微小RNA(miRNA)在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等过程起着十分重要的作用[1,2]。肿瘤细胞表面高表达的程序性死亡受体-配体1(programmeddeathligand-1,PD-L1)激活程序性死亡受体1(programmeddeath-1,PD-1)后,通过抑制T细胞的免疫活性而发挥负性调节作用。miRNA可特异性靶向PD-1/PD-L1,从而改变肿瘤的侵袭、迁移和免疫逃逸等生物学活性[3,4]。

1、PD-1/PD-L1信号通路

PD-1主要在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞以及自然杀伤细胞表面表达,通过传递负信号来限制T细胞介导的免疫应答。PD-1胞内结构域的C端和N端氨基酸残基有两个独立的磷酸化位点:免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM),而ITSM在免疫抑制中发挥重要作用,其在PD-1末端的细胞质中进行负调控,从而避免了对免疫系统的识别和攻击。PD-L1是PD-1的主要配体,主要由IgV样和IgC样胞外区、疏水性跨膜区和由30个氨基酸组成的短胞质尾组成。PD-L1可引起T细胞功能障碍。PD-1/PD-L1信号通路是癌细胞免疫逃逸的一个重要免疫检查点。PD-1与PD-L1结合时,可以激活细胞内信号通路,抑制细胞的免疫活性,从而导致促炎性因子和抗凋亡分子的下调,以及T细胞受体(TCR)信号的降低。PD-L1与PD-1的结合激活了PD-1/TCR抑制性微簇的形成,该微簇招募含同源结构域的酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2分子,这些磷酸酶将TCR信号通路的多个成员去磷酸化,抑制TCR下游的信号通路,导致T细胞功能障碍、衰竭或凋亡并最终导致肿瘤免疫逃逸[5]。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以促进CD4+及CD8+T细胞的增殖分化,并促进T细胞分泌多种细胞因子,是肿瘤免疫逃逸和肿瘤免疫治疗的理想靶点[6]。

2、调控PD-1表达的miRNAs

2.1神经胶质瘤

miR-15a/16参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药等一系列生物学过程。YANG等[7]发现,在GL261小鼠神经胶质瘤模型中,miR-15a/16的缺乏可增强CD8+T细胞的免疫应答;而miR-15a/16在肿瘤浸润性CD8+T细胞中的表达下调,导致PD-1的低表达和高活性,从而促进γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子的产生和增殖,进而抑制了肿瘤的生长并延长了小鼠的生存期。WEI等[8]研究发现,miR-138在CD4+和CD8+T细胞的过表达,可导致PD-1和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicT-lymphocyteantigen4,CTLA-4)的表达降低。在体内miR-138治疗免疫能力强的C57BL/6J小鼠胶质瘤,显示出明显肿瘤缩小,中位生存时间增加43%(P<0.05),且肿瘤内PD-1和CTLA-4表达减少;而在裸鼠免疫功能不全、CD4+或CD8+T细胞耗竭的情况下,这种治疗效果丧失,表明miR-138通过靶向免疫检测点来发挥抗胶质瘤的作用。

2.2黑色素瘤

miR-21是哺乳动物细胞中最丰富的miRNAs之一,它的缺乏促进了肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)向促炎性M1样表型的极化,从而起到抗肿瘤作用。TAMs可分化为具有免疫抑制作用并能促进肿瘤生长的M2样巨噬细胞。XI等[9]研究发现,miR-21通过负调控信号传导、转录激活因子1(STAT1)和蛋白质酪氨酸激酶(januskinase2,JAK2)的表达来阻断JAK-STAT信号通路,从而阻碍M1极化对TAMs的影响;体内实验进一步表明,小鼠黑色素瘤B16细胞系中,miR-21缺乏时会增强STAT1信号通路,上调巨噬细胞中PD-L1的表达,从而抑制巨噬细胞的抗肿瘤活性;当给小鼠注射PD-1抗体会明显增强抗肿瘤活性。LI等[10]研究发现,miR-28通过靶向PD-1修复耗竭T细胞分泌细胞因子并促进T细胞增殖,且miR-28抑制PD-1的表达;当从黑色素瘤细胞系B16F10小鼠中分离携带抑制性受体的耗竭T细胞用miR-28模拟物转染后,PD-1的表达降低,而转染miR-28抑制剂却能增加PD-1的表达;且T细胞免疫球蛋白-3(Tcellimmunoglobulin-3,TIM-3)和B/T淋巴细胞衰减因子(BTLA)的表达同样增加,这表明miR-28能够调控携带黑色素瘤小鼠T细胞上的PD-1、TIM-3和BTLA基因的表达。

2.3肝细胞癌

HUANG等[11]研究发现,PD-1是miR-374b的作用靶点,会增加细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的肿瘤靶向性并抑制肝细胞癌的进展。当用miR-374b模拟物转染CIK细胞时,可明显抑制CIK细胞中PD-1基因和蛋白表达,相反miR-374b抑制剂可显著上调PD-1的表达。ZHANG等[12]研究发现,位于PD-13′UTR的单核苷酸多态性rs10204525与慢性HBV感染有关,在具有rs10204525基因型GG的慢性HBV患者的淋巴细胞中,miR-4717模拟物可明显降低PD-1的表达,并增加TNF-α和IFN-γ的产生;然而miR-4717抑制剂可显著增加PD-1的表达并降低TNF-α和IFN-γ的产生;同时发现,与HBV相关的肝细胞癌患者外周血淋巴细胞中miR-4717水平明显降低,且miR-4717降低淋巴细胞PD-1的表达。JIANG等[13]研究发现,miR-802在肝癌患者外周血和肿瘤组织中表达上调,且高表达的miR-802与肿瘤预后不良相关;同时还发现,miR-802的过度表达导致PD-1的表达明显上调并下调IFN-γ的分泌,从而导致肝癌组织逃避免疫应答并抑制CD8+、CD28+T细胞的功能。

3、调控PD-L1表达的miRNAs

3.1肺癌

miR-34在多种肿瘤中不表达或低表达。CORTEZ等[14]研究发现,在非小细胞肺(NSCLC)癌患者中,p53通过调控miR-34a直接抑制NSCLC的PD-L1表达,且高表达PD-L1、低表达p53以及低表达miR-34a与患者不良的临床预后相关。p53通过miR-34a在344SQ同基因小鼠模型和H1299细胞中调节PD-L1,miR-34a增加了肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量,并减少了衰竭的CD8+T细胞、巨噬细胞和调节性T细胞的数量,特异性调节肿瘤免疫应答,表明miR-34a可能对免疫逃逸具有直接作用。此外,miR-34a和PD-L1在NSCLC中的表达呈负相关。上皮细胞-间充质转化(EMT)是一个可以增加癌细胞迁移和侵袭能力的重要过程,其可以被miR-200家族的成员逆转。这些基因簇通过靶向EMT诱导的锌指E盒结合同源框1(zinc-fingerE-boxbindinghomeobox1,ZEB1)降低癌细胞的侵袭和转移潜能;而ZEB1则可以直接抑制miR-200基因位点的转录[15]。CHEN等[16]研究发现,miR-200/ZEB1轴调控NSCLC肿瘤细胞PD-L1的表达,以及对肿瘤微环境中CD8+T细胞的抑制作用;PD-L1和miR-200B表达水平呈负相关,而EMT和PD-L1mRNA水平呈正相关,miR-200A/B通过靶向结合PD-L13′UTR来抑制人和小鼠肺癌细胞中PD-L1的表达,从而减少CD8+T细胞耗竭并抑制肿瘤转移。XIE等[17]研究发现,在NSCLC中miR-140呈低表达,PD-L1和细胞周期蛋白E(cyclinE)呈高表达。miR-140的过表达通过直接结合PD-L1的3’UTR抑制PD-L1的表达,同时cyclinE的表达降低以及A549和NCI-H1650细胞在S期的增殖受到抑制,从而抑制了肿瘤的增殖。这些结果表明,miR-140/PD-L1/cyclinE通路参与了NSCLC细胞周期的调节和细胞增殖,可能是抑制NSCLC细胞增殖的潜在治疗靶标。FUJITA等[18]研究发现,在对铂类化疗耐药的NSCLC中,PD-L1和miR-197的表达水平呈负相关并与肿瘤预后不良相关。miR-197通过与细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1B(CKS1B)的3′UTR结合直接靶向CKS1B,导致细胞增殖、迁移和侵袭减少;而miR-197/CKS1B通路的关键下游靶点STAT3通过与PD-L1基因的启动子区域结合,来调节PD-Ll的表达。在体外miR-197功能缺失促进A549和PC14细胞的侵袭和迁移,而细胞的生长不受影响,在体内利用肺癌异种移植模型,miR-197基因敲除可诱导肺转移的形成并促进化疗抵抗。

3.2乳腺癌

YANG等[19]研究发现,在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,PD-L1表达水平明显升高;通过萤光素酶测定显示,PD-L1是MDA-MB-231细胞中miR-195和miR-497的直接靶标,且PD-L1与miR-195和miR-497表达水平呈负相关,当用miR-195和miR-497模似物处理MDA-MB-231细胞可明显降低PD-L1基因和蛋白质的表达。miR-873在子宫内膜癌、肝癌和卵巢癌等恶性肿瘤中呈低表达,且对癌细胞的增殖、侵袭和耐药性等具有重要的调控作用[20,21]。GAO等[22]研究发现,在乳腺癌中miR-873直接靶向PD-L13′UTR来抑制PD-L1的表达,PD-L1的表达与乳腺癌干细胞特性标志物的表达呈正相关,而PD-L1的过表达通过激活PI3K/AKT和ERK1/2通路来促进乳腺癌干细胞特性和化疗抵抗性;miR-873在MDA-MB-231乳腺癌细胞中的过表达,通过抑制PI3K/Akt和ERK1/2通路来减弱其乳腺癌细胞的干性。因此,miR-873/PD-L1调节轴可作为治疗靶点,来降低乳腺癌细胞的干性,并增强对阿霉素等药物的化疗敏感性。miR-3609是新发现的一种内源性非编码RNA。LI等[23]研究发现,PD-L1是miR-3609在乳腺癌中的直接靶点,两者表达呈负相关,且miR-3609低表达和PD-L1高表达与患者预后不良和化疗耐药相关。转染miR-3609模拟物可显著抑制低表达miR-3609细胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-468)中PD-L1蛋白的表达,且呈剂量依赖性,并增加了MCF7/ADR细胞对阿霉素的敏感性;而转染miR-3609抑制物,可增强HBL-100和MCF-7细胞中PD-L1蛋白的表达。在体外,miR-3609通过阻断PD-L1免疫检查点,恢复乳腺癌对阿霉素的敏感性,提示miR-3609可作为乳腺癌的化疗靶点。

3.3胃癌

ZHAO等[24]研究发现,在幽门螺杆菌阳性的胃癌患者中,miR-140表达明显降低,而PD-L1表达显著增加,且两者呈负相关。通过调节PD-L1的表达,miR-140的过表达能显著抑制胃癌细胞的增殖,并对小鼠体内的肿瘤生长有明显的抑制作用,表明miR-140通过靶向免疫检查点分子PD-L1发挥抗胃癌作用。miR-152是miR-148/152家族的成员。WANG等[25]研究发现,miR-152在胃癌细胞中低表达,且miR-152的低表达与胃癌患者的临床分期、肿瘤大小和淋巴结转移率有关。当用miR-152模拟物转染胃癌细胞系(SGC-7901和AGS)后,PD-L1的表达下降;而转染miR-152抑制剂却能增加PD-L1的表达,表明miR-152通过直接与胃癌细胞PD-L13′UTR结合,抑制PD-L1的表达,进而促进T细胞增殖和细胞因子的产生,从而增强了肿瘤免疫应答。miR-940在胃癌血浆中表达的下调可作为检测胃癌的新型生物标志物[26]。FAN等[27]研究发现,PD-L1可以促进胃癌细胞系的增殖和迁移,STAT5a可以上调胃癌中PD-L1的表达,且STAT5a和PD-L1的表达水平呈正相关;而卡西塔斯B细胞淋巴瘤谱系-b(Cbl-b)通过诱导STAT5a泛素化,进而下调PD-L1表。

3.4结直肠癌

ZHAO等[28]发现,在结直肠癌中,miR-138-5p与PD-L1表达水平呈负相关,且miR-138-5p的低表达与淋巴结转移、临床分期和预后不良有关。miR-138-5p通过靶向PD-L13′UTR来抑制PD-L1的表达,进而发挥抑癌作用。在体外,miR-138-5p的过表达会阻止进入细胞周期的S期,而PD-L1的过表达可挽救这一效应。在体内,miR-138-5p的高表达水平与小鼠肿瘤生长减慢和PD-L1水平降低有关。这表明在结直肠癌患者中,用miR-138-5p模拟物阻断PD-L1通路可能是一种有效的治疗策略。miR-148a-3p是一种肿瘤抑制因子,miR-148a-3p表达降低与多种癌症的临床预后不良相关。ASHIZAWA等[29]用TCGA数据库综合筛选发现,在带有微卫星不稳定性高或错配修复缺陷的结直肠癌中,miR-148a-3p的表达下降,与PD-L1水平呈负相关;进一步研究证明,miR-148a-3p直接与PD-L1的3′UTR结合,降低了肿瘤细胞(HCT116和SW837)表面PD-L1的表达水平;在IL-2激活的T细胞和IFN-γ处理的肿瘤细胞共培养模型中,miR-148a-3p的过表达抑制了IFN-γ诱导的肿瘤细胞表面PD-L1的表达,从而减少了T细胞的凋亡。miR-93-5p位于7q22号染色体上,是miR-106b-25基因簇的一个成员,在多种肿瘤组织中异常表达。CHEN等[30]研究发现,在结直肠癌组织中miR-93-5p表达显著下调,PD-L1表达上调,且miR-93-5p和PD-L1表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期及患者的生存率密切相关。此外,miR-93-5p通过靶向PD-L1下调基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinases-1,MMP-1)、MMP-2和MMP-9的表达,抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭以及免疫逃逸。

3.5卵巢癌

miR-424(322)属于miR-16家族成员。XU等[31]发现,miR-424(322)在卵巢癌化疗耐药中调节PD-1/PD-L1通路,miR-424(322)与PD-L1、PD-1的表达呈负相关,miR-424(322)的高表达水平与卵巢癌患者无进展生存期延长呈正相关,而且与化疗耐药密切相关,miR-424(322)表达的恢复增强了卵巢癌细胞的敏感性,抑制PD-L1的表达,进而逆转T细胞免疫反应激活的化疗耐药,提示miR-424(322)在卵巢癌化疗耐药的免疫逃避中起重要作用。ZUO等[32]通过观察建立对顺铂(cisplatin,DDP)耐药的卵巢癌细胞株(SKOV3/DDP和A2780/DDP),发现DDP耐药细胞中PD-L1表达增加,而miR-34a-5p表达减少,沉默PD-L1可使细胞增殖减少、细胞周期G1期阻滞和凋亡增加。双荧光素酶报告分析证实,PD-L1是miR-34a-5p的靶基因,miR-34a-5p通过靶向PD-L1的3′UTR而负调控PD-L1的表达,PD-L1过表达能够逆转miR-34a-5p对SKOV3/DDP细胞的耐药性;miR-34a-5p的过表达能抑制经DDP处理的裸鼠体内A2780/DDP细胞的致瘤性。表明miR-34a-5p/PD-L1轴在卵巢癌化疗耐药中起关键作用。

4、讨论

PD-1/PD-L1免疫检查点在肿瘤免疫逃逸和肿瘤微环境的形成过程中起重要作用。PD-1/PD-L1靶向策略是免疫治疗的一个突破,它可以恢复T细胞的功能并促进免疫应答。MiRNA为理解PD-1/PD-L1信号通路的分子调控机制提供了新的途径。

参考文献：

[1]吕晓峰,洪汉卿,崔世红,等.微小RNA-451表达对卵巢癌细胞增殖能力及凋亡水平的影响[J].中国临床药理学杂志,2018,34(9):1095-1099.

罗小琴,刘小慧,赵云,刘朝奇.微小RNA调控程序性死亡受体1/程序性死亡受体-配体1在肿瘤中的研究进展[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2538-2542.

基金:湖北省重点实验室开放基金资助项目(2018KZL02)