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GRM1通过AKT/mTOR通路调控肾细胞癌细胞的生物学行为

2023-12-27 159 上传者：管理员

摘要：目的：探讨抑制GRM1对肾细胞癌(RCC)细胞增殖、迁移、侵袭等行为的影响及其潜在的分子机制。方法：采用RT-qPCR和免疫组化检测RCC肿瘤组织中GRM1的表达情况。采用慢病毒转染shRNA构建沉默GRM1的786-O细胞(786-O-shGRM1),并采用RT-qPCR和WB检测转染效率。采用CCK-8检测786-O-shGRM1的细胞活力，流式细胞术检测周期与凋亡，Transwell法检测迁移与侵袭。使用AKT激活剂SC79进行细胞处理后，同法检测细胞786-O-shGRM1的细胞活力、周期、凋亡、迁移与侵袭。结果：GRM1在RCC肿瘤组织的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.01)。沉默GRM1后786-O-shGRM1细胞的活力下降(P<0.01),细胞周期受阻断(P<0.01),细胞凋亡比例增加(P<0.01),细胞迁移及细胞侵袭受抑制(P<0.01)。AKT激活剂SC79可逆转抑制GRM1所致的细胞活力、周期、凋亡、迁移与侵袭的变化。结论：GRM1在肾细胞癌中高表达，通过抑制GRM1能够抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，且AKT/mTOR参与了该过程。

关键词：
AKT
GRM1
mTOR
肾癌
肾细胞癌
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肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)简称肾癌，是常见恶性肿瘤，占成人所有恶性肿瘤2%～3%,每年新增肾癌患者30万例，死亡10万例[1]。世界各地肾癌的发病率差异较大，亚洲地区发病率较低，但是近年来我国肾癌的发病率呈逐年上升趋势[2]。由于肾细胞癌对放疗、化疗均不敏感，其治疗效果较差，大约30%的患者在诊断时就发现了肿瘤转移，还有30%在治疗过程中出现了转移，转移性肾细胞癌5年生存率仅为2%,中位生存期为8个月[3,4]。有研究指出有代谢综合征的肾癌患者，其肿瘤细胞的侵袭性往往更高[5]。谷氨酸的代谢是细胞代谢中的重要组成部分，已有研究证实谷氨酸信号通路参与肿瘤的发生、进展。Pollock PM等人于2003年第一次报道了代谢型谷氨酸受体-1(GRM1)与肿瘤潜在联系[6]。Martino JJ等发现RCC中亲代谢型谷氨酸受体-1(mglur1)的表达影响肿瘤细胞的生长[7]。笔者推测GRM1可能参与RCC的发生发展，因此本研究首先分析GRM1在RCC患者肿瘤组织中的表达情况，其次通过慢病毒转染抑制RCC肿瘤细胞中GRM1的表达，观察GRM1对RCC细胞增殖、迁移、侵袭等的影响，及其可能存在的分子机制。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

人肾细胞癌组织及癌旁组织标本来自我院，人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)购自中科院上海生命科学研究院。DMEM培养基及胎牛血清来自美国 Gibco 公司。GRM1、mTOR、GAPDH抗体购自Proteintech公司。LY404039和SC79购自Selleck公司。转染试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、CCK-8试剂盒、即用型SP免疫组化试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。Transwell小室及基质胶购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养与转染

在无菌超净台中，将786-O细胞接种在含10% FBS和DMEM的培养皿，37℃、5%CO2的恒温培养箱培养。细胞以4×105/ml密度接种于6孔板，当细胞密度融合到70%～80%时，根据转染试剂盒说明进行转染，分为对照序列sh-NC和3组干扰序列shGRM1-1、shGRM1-2和shGRM1-3,并检测转染效率。sh-NC为非目标基因干扰序列，自身无功能，用以排除转染过程本身对细胞的影响。3组干扰序列相同，重复实验以减少误差。

1.3 细胞分组

抑制GRM1影响786-O细胞生物行为的实验分为对照组“786-O组”(即非干预状态),沉默基因对照组“786-O-shNC组”(即转染对照序列sh-NC,为无功能性非目标基因干扰序列，下文简称“shNC组”),GRM1沉默基因组“786-O-shGRM1组”(即转染干扰序列shGRM1后细胞不表达GRM1,下文简称“shGRM1组”)和GRM1抑制剂组“786-O+LY404039组”(即通过GRM1抑制剂LY404039抑制786-O细胞表达GRM1,下文简称“LY404039组”)。相关机制研究实验分为“786-O-shGRM1组”(同前所述),使用AKT激活剂组“786-O-shGRM1+SC79组”(即AKT激活剂SC79作用于经转染后GRM1被沉默的细胞，下文简称shGRM1+SC79组)和“786-O+LY404039+SC79组”(即AKT激活剂SC79作用于GRM1被抑制剂LY404039所影响的细胞)。

1.4 免疫组化染色

组织经固定、石蜡包埋、切片后，根据免疫组化试剂盒说明书步骤进行染色，DAB显色，脱水，透明，中性树胶封固。

1.5 RT-qPCR

肿瘤组织及各组细胞中的总RNA用Trizol试剂提取，且依实时荧光定量PCR试剂盒逆转录为cDNA,再进行qPCR。荧光定量计算循环数(Cycle threshold, CT),并绘制标准曲线，使用2-ΔΔCT方法进行定量计算。

1.6 蛋白质印迹技术(Western blot, WB)

裂解细胞提取总蛋白后将样本等量上样至SDS-PAGE凝胶，蛋白经电泳分离后恒流转至PVDF膜，5%脱脂乳粉封闭后加入一抗震荡孵育过夜，用TBST漂洗后室温震荡孵育二抗，经ECL试剂盒显色后通过使用凝胶成像分析仪扫描计算灰度值。

1.7 CCK-8

将各组细胞分别接种于96孔板(1×105/孔),每组至少设置6个重复孔。37℃恒温培养箱孵育，每孔加入10μl CCK-8 (0.5g/L)溶液培养4 h, 测定各孔细胞在波长450nm处的光密度(Optical density, OD)值。

1.8 流式细胞术

对数生长期细胞经细胞筛过滤及PBS洗涤后，取1×105个细胞经预冷75%乙醇4℃过夜处理后加入5μl PI染色液，避光混匀，流式细胞仪检测周期变化。取2×105个细胞经Binding buffer混悬后加入5μl FITC-AnnexinV和5μl PI,避光温育，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。

1.9 Transwell染色

Transwell小室的上室接种细胞(1×105个/孔，无血清培养基),下室加入完全培养基(含10%胎牛血清),孵育48h后分别经4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色后，拍照并计数统计以检测细胞迁移能力。Martrigel基质胶平铺于Transwell上室后温育。小室的上室接种细胞(1×105个/孔，无血清培养基),下室加入完全培养基(含10%胎牛血清)。孵育48h, PBS清洗去除未穿膜的细胞，4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色后，拍照并计数统计以检测细胞侵袭能力。

1.10 统计学方法

统计软件SPSS22.0用于数据分析，数据以(Mean±SD)表示，两两比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 GRM1在RCC肿瘤组织中高表达

RT-qPCR检测RCC组织中GRM1的表达水平(见图1a),与癌旁组织比较，RCC患者的肿瘤组织中GRM1 mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。免疫组化染色检测GRM1蛋白的表达水平(见图1b),与癌旁组织比较，GRM1蛋白在RCC患者肿瘤组织中呈明显阳性表达。这些结果表明GRM1在RCC肿瘤中高表达，提示GRM1与RCC的发生发展存在一定的关系。

图1 GRM1在RCC肿瘤组织中的表达情况

2.2 构建GRM1沉默的RCC肿瘤细胞株

与对照786-O-shNC组比较，荧光显微镜观察到786-shGRM1-1、786-shGRM1-2和786-shGRM1-3各转染组的荧光强度均减弱(见图2a),RT-qPCR检测到各转染组细胞中GRM1 mRNA水平均降低(均P<0.01,见图2b),WB检测各转染组细胞中GRM1蛋白水平均降低(均P<0.01,见图2c)。这些结果表明成功构建786-O-shGRM1稳转细胞系。

图2 shGRM1通过慢病毒系统构建的稳转7 8 6-O细胞系的干扰效率检测

2.3 抑制GRM1影响RCC肿瘤细胞的生物学行为

与对照786-O组比较，786-O-shGRM1组和786-O+LY404039组的细胞活力均下降(P<0.01,见图3),细胞周期受阻断(P<0.01,见图4),且细胞凋亡比例增加(P<0.01,见图5),细胞迁移和细胞侵袭均受抑制(P<0.01,见图6～7)。这些结果说明抑制GRM1能够抑制RCC肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，促进RCC肿瘤细胞的凋亡。

2.4 GRM1通过AKT/mTOR通路影响RCC肿瘤细胞的生物学行为

图3 CCK-8检测细胞的活力

图4 流式细胞术检测细胞的周期

为了探讨GRM1的作用机制，本节使用AKT激活剂(SC79)对细胞进行处理，观察各组细胞的生物学行为变化。与对照786-O-shGRM1组比较，使用AKT激活剂后，786-O-shGRM1+SC79组和786-O+LY404039+SC79组细胞活力均增强(P<0.01,见图8),且细胞中mTOR表达量升高(P<0.01,见图9),同时，G0/G1期的细胞比例降低(P<0.01,见图10),且细胞凋亡比例降低(P<0.01,见图11),细胞迁移增强(P<0.01,见图12),细胞侵袭增强(P<0.01,见图13),这些结果说明抑制GRM1可能通过AKT/mTOR途径影响RCC肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。

图5 流式细胞术检测细胞的凋亡

图6 Transwell检测细胞的迁移

3、讨论

RCC发病率上升与肥胖、高血压、吸烟、暴露等危险因素相关[8]。外科手术治疗仍是目前RCC的最终治疗方法，但是术后复发或转移率高，且对放化疗不敏感[9,10]。对于晚期肾癌，分子靶向药物的治疗效果较好，已成为晚期肾癌的一线治疗药物[11]。但是靶向药物耐药仍是一个比较常见及棘手的问题，所以研究RCC的发病机制，探讨新的治疗方法具有重要意义。

图7 Transwell检测细胞的侵袭

图8 CCK-8检测细胞的活力

图9 WB检测细胞mTOR蛋白的表达

有学者提出RCC拥有一个独立的代谢系统，其可能是一种代谢性疾病[12,13]。谷氨酸的代谢属于细胞代谢中的重要组成部分，谷氨酸受体家族已经被证实在肿瘤细胞分化、肿瘤进展、诊断及治疗中具有一定的价值。其中，代谢型谷氨酸受体-1(GRM1)失调会增加黑色素瘤的发生，GRM1可能是乳腺癌抗血管生成的治疗靶点，GRM1与结节硬化症患者室管膜下巨细胞瘤的发生有关[6,14,15]。Kalariti N等人也通过PCR技术证明GRM1相关mRNA在骨肉瘤细胞中过度表达[16]。也有文献报道GRM1在前列腺癌细胞株PC-3和LNCaP过度表达[17]。本研究通过对13例临床RCC肿瘤标本进行检测，结果显示GRM1在RCC肿瘤中高表达，提示GRM1可能与RCC的发生发展有关联。

图10 流式细胞术检测细胞的周期

图11 流式细胞术检测细胞的凋亡

图12 Transwell检测细胞的迁移

图13 Transwell检测细胞的侵袭

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路是细胞内的重要信号转导通路，在多种肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。PI3K/AKT信号通路在肾癌中适度突变，但高度活化。活化的AKT可以使大量的底物磷酸化，从而参与细胞病理及生理功能的各个方面，包括细胞生长、代谢及肿瘤发生及转移[18,19]。在肾癌中PI3K/AKT信号通路与VHL/HIF信号通路在大型信号网络中广泛交叉，促进了肾癌的发生发展。首先由于VHL丢失导致HIF上调，促进了多种生长因子的表达[20]。这些生长因子又反过来激活PI3K/AKT信号通路，从而激活mTOR然后促进HIF的表达，从而形成正循环[21]。已有文献报道GRM1通过PI3K/AKT信号通路调节了黑色素瘤的生长及发展，并且在此文献中使用利鲁唑(GRM1信号传导抑制剂)的黑色素瘤细胞中血管生长标记物及PI3K/AKT的下调[22]。本研究通过siRNA技术抑制GRM1在肾细胞癌细胞中的表达，结果发现抑制GRM1表达后能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，阻断细胞周期的G0/G1期，增强细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭。使用GRM1抑制剂LY404039处理肿瘤细胞，与基因沉默GRM1具有一致的效果。GRM1敲除细胞后，使用AKT激活剂SC79能够逆转GRM1受抑制而产生的一系列生物学行为，提示抑制GRM1影响肾细胞癌细胞生物学行为可能通过AKT介导。进一步对AKT下游蛋白mTOR进行检测发现抑制GRM1后mTOR的表达显著降低，AKT激活剂处理能够有效逆转mTOR的低表达。

综上所述，本研究明确了GRM1在肾细胞癌中高表达，通过抑制GRM1能够抑制肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡，且AKT/mTOR参与了该过程。当然，本研究仅对786-O细胞进行了生物学行为研究，后续还需在其他人肾癌细胞系中进行验证，并行动物实验以更深刻地理解GRM1在肾癌发生、发展的过程中所起到的作用。

参考文献:

[2]刘曙正,郭兰伟,曹小琴,等.中国2014年肾癌发病与死亡分析[J].中华流行病学杂志,2018,39(10):1346-1350.

[15]卢平,周育森,陈万荣,等.恶性黑素瘤细胞中的谷氨酸信号通路及其与细胞骨架蛋白分子的作用机制[J].中华皮肤科杂志,2009,42(8):575-578.

文章来源:卢颖.GRM1通过AKT/mTOR通路调控肾细胞癌细胞的生物学行为[J].医学理论与实践,2023,36(24):4154-4159.