嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(pheochromocytomas/paragangliomas, PPGLs)是一种罕见的神经内分泌肿瘤，遗传易感性高，其中以SDHx突变为主的假性缺氧型肿瘤恶性潜能大。约10%～17%的PPGLs会发生转移，转移性PPGLs治疗方案受限，患者预后不佳。近年来，免疫检查点分子抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)的出现为多种实体瘤患者提供了新的治疗选择。肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)是肿瘤微环境中的免疫成分，包含先天性及适应性免疫细胞、调节细胞内信号传导的细胞因子、趋化因子及细胞表面分子等，其在肿瘤发生发展及预测患者预后和对ICIs治疗的反应中发挥重要作用[1]。目前已有部分研究利用免疫组织化学染色、单细胞(核)转录组测序等方法初步描绘了PPGLs TIME图谱，因此本文主要针对其中免疫细胞浸润情况、免疫检查点分子表达及其与肿瘤基因背景和转移间的关系进行综述，旨在更好地理解TIME在PPGLs发生发展中的作用及机制，并为转移性PPGLs患者找寻新的治疗方案提供思路。

1、免疫细胞

TIME中浸润的免疫细胞依据功能可以分抗肿瘤和促肿瘤两大类，其功能及浸润模式与肿瘤患者预后及对免疫治疗的反应密切相关。

1.1 细胞毒性CD8+T淋巴细胞

细胞毒性CD8+T淋巴细胞是适应性免疫反应及抗肿瘤反应的主要效应细胞，可以通过产生颗粒酶、穿孔素、TNF-α等物质发挥细胞毒作用。CD8+T淋巴细胞浸润高的实体肿瘤对免疫治疗反应更好，如非小细胞肺癌、黑色素瘤等。然而，研究表明相比于其他肿瘤，PPGLs中浸润的CD8+T淋巴细胞极少[2,3,4,5,6,7]。一项包含81例PPGLs的研究仅在20%的肿瘤中发现了CD8+T细胞的浸润，其余大多数肿瘤都处于缺乏CD8+T细胞浸润的免疫荒漠化状态或CD8+T细胞无法浸润肿瘤内部的免疫排斥状态[7]。这可能是由于PPGLs分泌过量的儿茶酚胺，后者作用于细胞表面的肾上腺素和多巴胺受体，抑制了淋巴细胞的增殖和功能。此外，研究还发现CD8+T浸润水平与PPGLs肿瘤大小呈负相关[8],且在恶性程度高或转移性肿瘤中浸润更少[8,9]。

缺氧能够激活缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)信号通路及其下游分子乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达，促进糖酵解进程及乳酸的生成，后者堆积会损伤CD8+T细胞的功能。假性缺氧型PPGLs主要由琥珀酸脱氢酶(succinate dehydroge-nase, SDHx)基因失活突变引起，由于底物琥珀酸的堆积，使得在氧水平正常的条件下也能够激活HIF-2α信号通路。相比于其他亚型，假性缺氧型PPGLs更易发生转移。部分研究证实PPGLs中CD8表达水平与HIF-2α及LDHA呈负相关，且相比于其他亚型PPGLs, 假性缺氧型或SDHx突变型肿瘤中CD8+T淋巴细胞浸润更少，这种趋势在转移性肿瘤中仍然存在[2,7]。Gudgeon等还发现微环境中堆积的琥珀酸能够通过细胞膜表面的单羧酸转运体1进入胞内，阻碍了三羧酸循环，进而抑制了T细胞脱颗粒和IFN-γ的分泌[10]。研究还证实SDHx突变型PPGLs中IFN-γ下游基因的表达水平显著低于其他突变型肿瘤[10]。

1.2 辅助性CD4+T淋巴细胞

CD4+T淋巴细胞在不同刺激下可以分化成不同亚群，如Th1、Th2及Th17等，各亚群通过分泌不同类型细胞因子发挥抗肿瘤或促肿瘤的作用。PPGLs相关研究表明CD4+T细胞浸润少于CD8+T淋巴细胞[5,8]。在胰腺神经内分泌肿瘤中，CD4+T细胞浸润增加与患者预后差相关。而在PPGLs中结论相反，研究表明CD4+T细胞浸润减少与肿瘤转移、局部侵袭[2,9]及琥珀酸脱氢酶复合体B亚基(succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B,SDHB)突变相关[2],提示其主要发挥抗肿瘤免疫作用。然而目前还没有研究评估不同亚群CD4+T细胞在PPGLs中的功能。

1.3 自然杀伤(NK)细胞

NK细胞是固有免疫的重要组成部分，主要发挥细胞溶解功能，能够直接杀伤肿瘤细胞，并影响其他免疫细胞的抗肿瘤行为。在其他神经内分泌肿瘤中，活化的NK细胞浸润与疾病早期、稳定状态及非转移表型相关。而在PPGLs中，研究同样发现转移性肿瘤中活化的NK细胞浸润更少，而休眠的NK细胞浸润更多，且前者是转移的独立预测因素[6,9,11]。这可能与转移性肿瘤中负责招募NK细胞的趋化因子CCL3和CCL4表达水平低有关[11]。此外，研究还发现SDHx突变的假性缺氧型PPGLs中活化NK细胞浸润少于其他亚型[11]。

1.4 肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)

单核/巨噬细胞(CD68+)具有高度可塑性，在不同细胞因子的刺激下可以分化为M1型或M2型巨噬细胞。M1型表达CD86分子，主要发挥促炎抗肿瘤细胞作用；而M2型表达CD163和CD206分子，发挥抗炎促肿瘤作用。TAMs更接近于M2型，通过分泌IL-10、PDE2等诱导Treg细胞的产生，抑制T淋巴细胞功能。在大多数肿瘤中，巨噬细胞浸润增加与患者预后不良相关。研究表明巨噬细胞是PPGLs TIME中浸润最多的免疫细胞[2,3,4,6,8,12,13,14],其浸润程度受到年龄的影响[15],与血浆肾上腺素水平呈正相关[2,8],与肿瘤大小呈负相关[8]。PPGLs中浸润的巨噬细胞多为M2型[15],与正常肾上腺组织相比，肿瘤组织浸润的巨噬细胞高表达促血管生成和促肿瘤的分子PLXDC1 (Plexin domain-containing protein, Plexin结构域包含蛋白)和PLAU(plasminogen activator, urokinase, 尿激酶型纤溶酶原激活物)[6]。

免疫组织化学染色和转录组生物信息学分析结果均发现M2型巨噬细胞浸润增多及M2/M1比值高与肿瘤侵袭和转移相关[2,8,9]。这与其他肿瘤中的研究结果一致。M2型巨噬细胞能够分泌CCL18分子，诱导肿瘤血管生成，抑制免疫反应，促进肿瘤进展。Chen等证实CCL18分子高表达与PPGLs患者预后不良相关[16]。

在其他肿瘤中，肿瘤细胞释放到微环境中的琥珀酸盐与巨噬细胞表面琥珀酸受体(SUCNR1)结合后激活了下游PI3K-Akt-HIF1α信号通路，进而诱导了M2型巨噬细胞相关基因的转录[17]。研究者发现SDHx突变的假性缺氧型PPGLs中，SUCNR1表达水平更高，M2型巨噬细胞浸润更多[12],M2/M1比值更高[2],这可能与上述机制相关。也有部分研究结果不同，他们发现VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor)突变型肿瘤中M2巨噬细胞标志物表达最高[6]。

1.5 中性粒细胞

中性粒细胞为外周血中的杀伤细胞，可分泌大量细胞因子维持炎性反应。Zhong等发现PPGLs患者术前外周血中高中性粒/淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)和血小板/淋巴细胞比值(platelet-lymphocyte ratio, PLR)是总生存期(overall survival, OS)和无转移生存期短的独立危险因素[18]。此外，在肿瘤细胞和TAMs释放的趋化因子的刺激下，外周血中性粒细胞可被招募至肿瘤内并极化成不同功能的肿瘤相关中性粒细胞。然而免疫组化染色结果表明中性粒细胞在PPGLs肿瘤组织中浸润极少，且与肿瘤恶性无关[2]。

2、免疫检查点分子

免疫检查点分子是位于免疫细胞表面的受体，与配体结合后，通过传递抑制或刺激信号发挥调节免疫反应和维持自身免疫耐受的作用。

2.1 PD-1/PD-L

PD-1能够与PD-L1和PD-L2两种配体结合，后两者在正常组织中表达水平均较低，而在肿瘤细胞表面高表达。PD-L1与活化T细胞表面的PD-1结合后，抑制了T细胞的增殖和功能，诱导免疫逃逸。PD-L2则是Th2细胞的重要调节剂。目前研究主要应用免疫组化染色法评估PD-L的表达水平，并发现高表达PD-L1的患者对ICI治疗反应更佳，治疗后OS更长。

与正常肾上腺髓质相比，PD-L1在PPGLs肿瘤组织中表达更高[19],且在肿瘤细胞及部分淋巴细胞中均有表达[20]。Celada等[7]及Pinato等[21]利用免疫组化方法分别在103例及100例PPGLs肿瘤组织中评估了PD-L1的表达，结果发现分别有16.7%及18.0%的肿瘤表现为PD-L1阳性，这一比例显著低于非小细胞肺癌、黑色素瘤、宫颈癌等其他肿瘤。然而Guo等[20]的研究却发现PD-L1阳性率为59.7%,这种异质性可能与纳入的肿瘤起源部位不同相关。Celada等[7]发现交感来源的肿瘤中PD-L1阳性表达多于副交感神经来源肿瘤，前者以分泌过量儿茶酚胺为特征，可通过β-肾上腺素能信号通路上调PD-L1的表达[22]。此外，大多数研究发现转移性PPGLs中PD-L1阳性率显著高于非转移性肿瘤[7,21,23],且其阳性表达与肿瘤Ki-67指数≥3%相关[20]。Pinato 等[21]还发现了PD-L2阳性表达与肿瘤转移、脉管侵袭及患者OS短相关，并利用转录组富集分析证实PD-L2表达与免疫耗竭、TGF-β信号通路、Treg细胞标志物及Tim-3、 CTLA-4等免疫检查点分子的表达相关。

PD-L表达受多种机制调控，缺氧是其中之一。缺氧能够激活HIF-1α和HIF-2α表达，两者与PD-L编码基因启动子区域的缺氧反应元件结合后，上调其表达。Fischer等[24]在头颈部副神经节瘤(paragangliomas, PGLs)中证实了缺氧对PD-L1的诱导作用。其他研究也表明PPGLs中PD-L1、PD-L2表达水平与HIF-1α、HIF-2α呈正相关[21,24]。然而，尽管假性缺氧型肿瘤中HIF信号通路被激活，但大多数研究却发现激酶通路激活型或MAML3融合突变的Wnt-altered型肿瘤中PD-L1的表达更高[7,9,19,25]。既往研究表明PD-L1表达代表了T细胞介导的炎性TIME,且在PPGLs中与CD8的表达呈正相关[7],因此假性缺氧型肿瘤中CD8+T淋巴细胞的浸润缺乏可能导致了PD-L1的低表达。

3、免疫相关亚型

研究者利用TIME中免疫细胞浸润情况及肿瘤转录组提出了不同的免疫分型策略，用于评估患者预后及预测免疫治疗疗效。Jin等[5]及Kim等[26]分别利用免疫组化染色和转录组生物信息学分析发现超过70%的PPGLs表现为缺乏CD8+T淋巴细胞浸润的“免疫冷型”或“免疫缺陷型”。有研究者依据TIME中淋巴细胞浸润及PD-L1表达情况，将TIME归纳为4型。其中黑色素瘤归为Ⅱ型，表现为富于淋巴细胞浸润且PD-L1表达水平高，因此其对ICIs治疗反应佳。然而既往研究结果表明PPGLs多为Ⅰ型，即缺乏淋巴细胞浸润且PD-L1表达水平低，提示其对ICIs反应差。Ghosal等[11]还发现非转移性及激酶通路激活型肿瘤相关免疫亚型以活化NK细胞浸润为主要特征，而侵袭性及假性缺氧型肿瘤相关免疫亚型多表现为M0巨噬细胞和Treg细胞浸润及TGF-β信号通路激活，提示这些肿瘤处于免疫抑制增强的状态。Calsina等[9]的研究结果相似，他们发现转移性PPGLs和假性缺氧型肿瘤多表现淋巴细胞耗竭亚型，而该亚型肿瘤通常进展更快。

4、PPGLs免疫相关治疗

4.1 免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗

PD-1/PD-L1抑制剂能够抑制PD-1/PD-L1间的相互作用，阻止T细胞的抑制信号传导，恢复其抗肿瘤功能，在实体瘤的治疗方面显示出了巨大的潜力。其疗效与肿瘤抗原性、PD-L1表达及淋巴细胞浸润情况密切相关。肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)和微卫星不稳定性(MSI)可用于评估肿瘤抗原性。然而，既往研究表明PPGLs处于MSI稳定状态，TMB远低于其他肿瘤，PD-L1表达阳性率及表达水平低，且肿瘤内CD8+T细胞浸润少，均提示其可能对ICIs单药治疗反应不佳。但针对于该类“免疫荒漠型”肿瘤，联合放疗、化疗或靶向治疗似乎可以通过提高肿瘤抗原性、直接或间接激活免疫反应等机制提高肿瘤细胞对ICIs的反应。然而目前尚缺乏PPGLs相关临床研究提供证据支持。目前仅有一项Ⅱ期临床研究评估了帕博利珠单抗在治疗转移性PPGLs中的疗效结果，11例患者≥4个月(9个周期)的疾病控制率达73%,中位无进展生存期为5.7个月[27]。部分病例报道表明转移性PPGLs在无法接受放化疗或放化疗疗效受限时，单药及联合免疫治疗能够提供一定帮助[28]。

4.2 其他

Papewalis等[29]在体内外实验中证实以CgA为靶点的树突状细胞(dendritic cell, DC)疫苗能够诱导CD8+T淋巴细胞浸润及细胞毒性免疫反应，并抑制肿瘤生长。动物实验表明MBTA联合治疗(TLR配体联合抗CD40单抗和甘露聚糖锚定)能够增加肿瘤中免疫细胞浸润、诱导CD4+T细胞的长期抗肿瘤免疫记忆，抑制注射原位及远处PPGLs的生长，延长荷瘤小鼠的生存[30]。

5、总结与展望

综上所述，PPGLs多为免疫荒漠型，以发挥促肿瘤作用的M2型巨噬细胞浸润为主，而抗肿瘤免疫细胞浸润极少，且PD-L1阳性率明显低于其他肿瘤。其中M2型巨噬细胞浸润增加，CD8+T淋巴细胞和活化NK细胞浸润减少及PD-L1高表达可能介导了PPGLs肿瘤免疫逃逸及转移的发生。在SDHx突变的假性缺氧型肿瘤中，HIF信号通路的激活及琥珀酸的堆积可能导致CD8+T淋巴细胞浸润缺乏及抑制性TIME的形成。尽管部分动物实验及临床研究表明ICIs治疗转移性肿瘤有效，然而PPGLs中TIME相关研究尚缺乏，未来需要结合单细胞多组学等技术解析不同亚型免疫细胞功能，并开展大样本临床研究为ICIs单药或联合用药治疗转移性PPGLs提供可靠证据，同时建立基于患者预后及对ICIs治疗反应的PPGLs特异性免疫分型策略。

基金资助:中央高水平医院临床研究专项(2022-PUMCH-C-028);中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-C&T-B-002);

文章来源:周玥,童安莉.嗜铬细胞瘤/副神经节瘤免疫微环境[J].基础医学与临床,2024,44(06):742-747.