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天马颗粒剂通过TLR4/NF-κB/Klotho途径调控大肠癌裸鼠移植瘤研究

2024-02-09 135 上传者：管理员

摘要：目的:观察天马颗粒剂对大肠癌裸鼠移植瘤组织中TLR4、NF-κB、Klotho表达的影响。方法:以SPF级裸鼠为研究对象，通过皮下种植HCT116细胞株构建裸鼠移植瘤模型，随机分为3组：对照组、天马颗粒低剂量组、天马颗粒正常剂量组，对照组予生理盐水20 mL/kg,天马颗粒低剂量5.39 g/kg;天马颗粒正常剂量10.79 g/kg;灌胃给药，隔天1次，持续2周。摘除肿瘤组织，测量肿瘤体重及体积，免疫组化检测TLR4、NF-κB、Klotho表达量。结果:同对照组相比，天马颗粒正常剂量组肿瘤组织中TLR4、NF-κB表达降低，Klotho表达明显增加(P<0.05);天马颗粒正常剂量组与天马颗粒低剂量组相比，肿瘤组织中TLR4、NF-κB表达未见明显差异(P>0.05),Klotho表达升高(P<0.05)。结论:天马颗粒剂可抑制TLR4/NF-κB通路活性，促进Klotho表达，降低肿瘤中炎性因子表达，改善肿瘤炎症微环境。

关键词：
Klotho
NF-κB
TLR4
大肠癌
天马颗粒剂
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大肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，2020年全球癌症新发病例中大肠癌发病率位居第三，其死亡人数占总癌症死亡人数的9.4%,排列第二，仅次于肺癌[1]。有研究表明，炎症因子通过激活细胞表面炎性受体可促使大肠癌细胞复发及转移[2]。TLR4在激活先天免疫、宿主防御病原体及调节慢性炎症风险等方面有重要作用，其表达水平上升可诱发局部炎症反应，促进肿瘤发展[3]。炎症可通过激活TLR4/NF-κB信号通路抑制结直肠癌细胞klotho基因表达，而当NF-κB被抑制时，Klotho在大肠癌中的表达显著增加[4]。Klotho基因作为抑癌基因与大肠癌密切相关，且具有多靶点抗肿瘤的作用。天马颗粒剂在针对大肠癌的临床治疗中效果显著，能提高患者生活质量，提高五年生存率并降低术后局部复发[5]。本研究对天马颗粒剂是否通过TLR4/ NF-κB/Klotho途径调控大肠癌裸鼠移植瘤进行验证研究，报道如下。

1、实验材料

1.1 实验动物

SPF级裸鼠，雌雄各半，16～20g, 24只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物质量合格证：430727201101778068,许可证：SCXK2019-0004。

1.2 实验细胞

HCT116细胞，由中国科学院上海细胞库提供，采用含胎牛血清培养基，于37℃,5%CO2饱和湿度下常规培养。

1.3 实验中药

天马颗粒剂由蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、醋三棱、胆南星、海藻、黄芪、山药、大黄配伍而成，购于湖南中医药大学第二附属医院中草药房。

1.4 实验主要试剂与实验仪器

Klotho抗体(北京博奥森生物技术有限公司),NF-κB抗体(北京博奥森生物技术有限公司),TLR4抗体(北京博奥森生物技术有限公司);柠檬酸钠缓冲液(PH6.0),封闭缓冲液(正常山羊血清),DAB显色液(A液1 mL+B液10μL);轮转式切片机(RM2245),生物组织摊烤片机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司YT-7F型),自动组织脱水机(HP300);显微镜(奥林巴斯BX53)。

2、实验方法

2.1 造模与分组

于裸鼠右侧小腿旁注射HCT116细胞150～200μL(细胞密度为1×107个/mL),注射完成后测量小鼠体重，大约17～20 g/只，2周后肿瘤细胞长成直径为2～3 mm大小时，表明接种成功，采用随机数字表法将24只成瘤裸鼠分为3组，分别为对照组、天马颗粒低剂量组、天马颗粒正常剂量组，每组8只。

2.2 药物干预

对照组予生理盐水20 mL/kg,天马颗粒低剂量组予天马颗粒5.39 g/kg,天马颗粒正常剂量组予天马颗粒10.79 g/kg(等效剂量)。灌胃给药，隔天1次，持续2周，并隔日观测裸鼠移植瘤瘤体体积变化。

2.3 取材

灌胃结束后第1天取材，脱颈处死裸鼠，摘取肿瘤组织，测量瘤体重量，行石蜡包埋并切片。剩余瘤体组织存入-80℃冰箱保存。

2.4 免疫组化检测

采用石蜡切片脱蜡处理至水化，流水冲洗干净后，使用蒸馏水冲洗5 min,行抗原修复：切片置于柠檬酸钠缓冲液中煮沸15 min,切片自然冷却后，流水冲洗，蒸馏水冲洗1 min,浸泡于3%过氧化氢内20 min,阻断内源性过氧化物酶，流水稍冲洗，蒸馏水冲洗，使用PBS冲洗3次，每次3 min。用吸水纸吸去玻片上多余的液体，滴加封闭缓冲液(正常山羊血清),置于37℃烤箱内孵育30 min;甩去多余封闭液，将配好的一抗直接滴加在切片组织上，置于4℃冰箱内过夜；一抗工作液孵育后复温，PBS冲洗3次，每次3 min;用吸水纸吸去玻片上多余的液体，滴加二抗，置于37℃烤箱内孵育30 min;二抗工作液孵育后复温，PBS冲洗3次，每次3 min;每张切片滴加新鲜配制的DAB工作液孵育3～5 min,光学显微镜下观察染色结果，达到合适的显色强度后，用蒸馏水洗涤切片，适时终止显色；使用苏木素染液衬染；流水冲洗后，切片依次浸入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片。显微镜下进行染色观察。

2.5 免疫组化评分

免疫组化评分=细胞染色强度评分×阳性细胞百分比评分。细胞染色强度评分：无阳性着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞百分比：0%～5%计0分，6%≤25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。

2.6 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理。计量资料如数据服从正态分布、各组间方差齐性时，采用单因素方差分析，如不符合，采用Kruskal-Wallis H检验。

3、实验结果

3.1 实验动物情况

实验过程中共有3只裸鼠死亡，其中对照组1只，天马颗粒低剂量组1只，天马颗粒正常剂量组1只。

3.2 各组瘤体情况

比较3组瘤体的体质量及体积变化，差异均无统计学(P>0.05)。见表1。

表1瘤体质量与瘤体积变化

3.3 3组肿瘤组织标本中Klotho蛋白表达

天马颗粒正常剂量组中Klotho蛋白的表达高于对照组与天马颗粒低剂量组(P<0.05),见表2。各组Klotho蛋白的具体表达情况，见图1。

图1各组Klotho蛋白表达情况

3.4 3组肿瘤组织标本中NF-κB的表达

NF-κB在天马颗粒正常剂量组中的表达低于对照组(P<0.05),但与天马颗粒低剂量组相比无统计学差异(P>0.05),见表2。NF-κB在3组标本中的表达情况，见图2。

图2各组NF-κB表达情况

3.5 3组肿瘤组织标本中TLR4的表达

TLR4在天马颗粒正常剂量组中的表达低于对照组(P<0.05),但与天马颗粒低剂量组相比无统计学差异(P>0.05),见表2。TLR4在3组中的表达情况，见图3。

图3各组TLR4表达情况

表2 Klotho、NF-κB、TLR4的表达Me(P25,P75)

4、讨论

中医认为大肠癌的病机为本虚标实，标实之毒可分为癌毒、热毒、痰毒、湿毒、瘀毒，本虚则为五脏亏虚，以先后天亏虚为主；“毒”和“虚”贯穿疾病发生发展的整个过程[6]。治疗上多标本兼治、祛邪扶正，采用“解毒、祛痰、化瘀、补虚”的治则。天马颗粒剂组方为蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、醋三棱、胆南星、海藻、黄芪、山药、大黄。方中蜈蚣、全蝎攻毒散结消肿；半边莲、黄柏清热解毒消肿；三棱采用醋制，缓其剽悍伤正之性得缓，取其破血行气、祛瘀消肿、消积止痛之功；胆南星化胶着之痰；海藻软坚散结，加之黄芪益气、扶正培本，托毒外出；山药滋阴，防他药耗气伤阴；大黄引邪自大便外出。全方共奏攻毒祛邪、祛瘀消肿、化痰散结、益气养阴之功，符合“攻、解、化、散、托”法在大肠癌治疗中的科学内涵。本方以攻毒祛邪为主，兼以扶正培本，从而达到“祛邪不伤正，扶正不留邪”的目的，符合大肠癌患者“毒、瘀、痰、虚”的病因病机特点。

TLR4作为Toll样受体中的一员，广泛存在于各种细胞中，可增强肿瘤细胞的增殖和存活，促进转移[7]。肠癌组织中TLR4蛋白及mRNA表达水平明显增强，且其表达水平与患者分化程度、TNM分期以及淋巴结转移情况相关[3]。MiR-6869-5p可通过靶向TLR4/NF-κB信号抑制结直肠癌的功能[8]。SKAP2通过抑制TLR4-NF-κB通路来防止过多的炎症，并且其通过SHP-1和SHP-2激活TLR4-IFNβ通路，从而抑制炎症介导的肿瘤发生[9]。综上，TLR4可通过多种通路调控结直肠癌发生发展，其中TLR4/NF-κB相关信号通路对于大肠癌的进展过程起到不可忽略的作用。众多研究表明，中草药可通过抑制TLR4/NF-κB的表达从而调控大肠癌的增殖与迁移。如小柴胡汤对肿瘤进展作用的潜在机制涉及TLR4/MyD88/NF-κB信号的下调[10],黄芪多糖(APS)通过抑制革兰氏阴性病原体，减少LPS的释放，抑制TLR4/NF-κB信号通路，阻止结肠炎相关癌的发生[11]。与本实验中TLR4、NF-κB在天马颗粒剂干预下表达下调一致。

Klotho是潜在的抑癌因子，Klotho在大肠癌细胞系中低表达甚至不表达，这与本实验中对照组免疫组化结果一致，其在大肠癌组织中的表达水平也较癌旁组织显著降低[12]。Klotho的表达与肿瘤患者的预后相关[13]。其表达受多因素调控。在既往研究中，FLI-1在结直肠癌细胞中发挥肿瘤抑制因子的作用，并正向调节Klotho信号[14]。SOX17可以与Klotho基因的启动子结合，增强Klotho基因的表达[15]。Klotho高表达可调控ERK / HIF1α轴抑制癌细胞有氧糖酵解[16]。因此本研究采用天马颗粒干预大肠癌成瘤模型，通过免疫组化检测分析TLR4、NF-κB、Klotho三者在肿瘤组织中的表达情况，以探究天马颗粒剂抑制大肠癌发生发展的机制。

本研究显示，天马颗粒剂可有效提高Klotho在肿瘤组织中的表达，抑制NF-κB及TLR4的表达，因此天马颗粒剂可能通过抑制TLR4/NF-κB,上调Klotho的表达，从而抑制肿瘤的发生发展。

参考文献:

[3]陈炜,许正国,杨永志.Toll样受体2和Toll样受体4在结直肠癌组织中的表达及其意义[J].中国卫生检验杂志,2021,31(13):1589-1592.

[5]彭天书,谢彪,聂甜,等.天马颗粒剂在抑制结直肠癌术后肿瘤复发中的临床效果[J].中药药理与临床,2016,32(3):191-193.

[6]张涛,丁宁,罗宏标,等.何永恒教授从“毒､虚”辨治结直肠癌经验[J].湖南中医药大学学报,2022,42(6):1023-1028.

[8]闫书山.MiR-6869-5p靶向TLR4/NF-κB信号抑制结直肠癌的功能及机制研究[D].南京:南京医科大学,2018.

[11]刘雷蕾,马淑然.基于肠道菌群介导的炎性反应研究黄芪多糖对结肠炎相关癌症的作用[J].世界中医药,2021,16(2):226-237.

基金资助:国家自然科学基金青年基金项目(81704089);湖南省自然科学基金青年基金项目(2018JJ3400);长沙市杰出创新青年计划(kq1707012);湖南省自然科学基金(2021JJ40413);湖南省中医药防治肛肠疾病重点研究室基金资助(湘中医药函[2020]51号);

文章来源:姚欣,袁婉婧,何永恒等.天马颗粒剂通过TLR4/NF-κB/Klotho途径调控大肠癌裸鼠移植瘤研究[J].亚太传统医药,2024,20(02):11-14.