虽然大多数伯基特淋巴瘤对化疗药物敏感，但进展期伯基特淋巴瘤因化学药物耐药而治疗效果欠佳。目前关于PI3K/AKT/mTOR通道介导多药耐药的机制尚不明确，但已在多种耐药细胞中检测出该通道异常表达，并且抑制该通道可逆转化疗药物耐药[1,2,3,4]。本课题组前期研究已证实了PI3K/AKT/mTOR信号通道在伯基特淋巴瘤中异常激活[5],抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道可抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖[6,7]。本研究拟将诱导建立耐阿霉素伯基特淋巴瘤RAJI细胞系，通过NVP-BEZ235抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道，进行耐药逆转研究。

一、材料和方法

试剂与仪器

阿霉素(DOX)购自美国辉瑞制药公司。NVP-BEZ235购自美国Selleckchem公司。RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco 公司。免抗人β-actin抗体购自上海碧云天生物技术研究所。高灵敏度化学发光测试试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。辣根过氧化物标记山羊抗小鼠IgG和辣根标记山羊抗兔IgG均购自北京康为世纪生物科技有限公司。免抗人p-Akt(Thr308)、免抗人p-mTOR、免抗人多药耐药蛋白/P-糖蛋白抗体、免抗人Akt和免抗人mTOR均购自北京博奥森生物技术有限公司。生物安全柜、超低温冰箱Forma-80 ℃和二氧化碳培养箱均为美国Thermo公司产品。倒置荧光显微镜Eclipse TS100为日本Nikon公司产品。全自动高压灭菌器MLS-3750为日本Sanyo公司产品。全功能自动酶标仪为山东Tecan公司产品。精密移液器、低温高速离心机均为芬兰Eppendorf公司产品。台式冷冻离心机为美国Beckman公司产品。凝胶成像系统ChemiDoc XRS为美国Bio-Rad公司产品。

耐阿霉素(DOX)细胞株的建立

RAJI细胞购自凯基生物技术股份有限公司。对数生长期的伯基特淋巴瘤细胞RAJI加入含阿霉素(DOX)的RPMI1640培养液(10% FBS),阿霉素初始浓度为10 nmol/L, 2-3 d半量换液，2周左右增加DOX浓度，每次增加10 nmol/L, 细胞状态不佳时停止增加DOX浓度，至生长状态恢复后再加量。6个月后 DOX浓度达到100 nmol/L,利用SPSS 17.0软件测定IC50,测定细胞耐药指数，并冻存部分细胞，命名为RAJI/DOX1。然后继续培养9个月后达到 DOX终浓度150 nmol/L,之后保持药物浓度不变，并冻存部分细胞，命名为RAJI/DOX2。细胞在进行检验前一周停止加入DOX。

耐药指数测定

取对数生长期的RAJI、RAJI/DOX1、RAJI/DOX2细胞分别以每孔1×104细胞接种于96孔细胞培养板中，37 ℃、5% CO2条件下培养。设立10、50、100、200、500、800、1 000 nmol/L 7种不同DOX浓度组，设含10%胎牛血清1640培养基、MTT、阿霉素为调零组。培养48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl后，继续培养4 h, 离心弃上清，再加入二甲基亚砜150 μl溶液。用酶标仪测出每孔吸光度值(OD值),计算细胞生长抑制率，重复实验3次。利用SPSS 17.0软件求出半数抑制浓度(IC50),测定耐药指数(R因子),公式如下：

蛋白免疫印迹测定P-糖白(Pgp)表达

收集1×106细胞于15 ml离心管中；按1 ml RIPA裂解液加10 μl PMSF配制细胞裂解液，使PMSF终浓度为1 mmol/L;每管细胞加200 μl含PMSF的裂解液；将细胞裂解混合液全部移至预冷的1.5 ml离心管中；用酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，测定5 μl样品总蛋白含量；60 V电泳约50 min后调整电压为80 V进行分离胶电泳；按海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫顺序进行转膜；加入一抗、二抗，加入底物显色后曝光；用Quantity one 2.1软件分析各条带的灰度值，以β-actin为内参照，计算Pgp/β-actin比值，用以判断Pgp表达水平的变化。

MTT测定细胞增殖

取对数生长期的RAJI、RAJI/DOX1、RAJI/DOX2细胞分别以每孔1×104细胞接种于96孔细胞培养板中，37 ℃,5% CO2条件下培养。设含10%胎牛血清1640培养基、MTT为调零组，使每孔最终体积为200 μl, 每个浓度设4个复孔。培养48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl后，继续培养4 h, 离心弃上清，再加入二甲基亚砜150 μl溶液。振荡温育30 min, 在自动酶标读数仪上比色，波长490 nm, 测出每孔吸光度值(OD值)。重复实验3次。

蛋白免疫印迹法测定p-AKT、p-mTOR表达

本部分有4组细胞，包括RAJI亲本细胞组、RAJI/DOX1中度耐药组、RAJI/DOX2高度耐药组，以及RAJI/DOX2经NVP-BEZ23(100 nmol/L)培养12 h后称为RAJI/DOX2-N组，检测各组细胞中p-AKT、p-mTOR的表达变化。

NVP-BEZ235对耐阿霉素细胞株逆转耐药研究

设立10、50、100、200、500、800、1 000 nmol/L 7种不同NVP-BEZ235浓度组单独、联合同浓度10、50、100、200、500、800、1 000 nmol/L 7 个DOX浓度组，与RAJI/DOX2细胞培养48 h, 利用MTT法测定其增殖变化。

统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量数据以

二、结果

细胞形态的变化

RAJI亲本细胞、RAJI/DOX1、RAJI/DOX2三组细胞在形态上并无太多差别，显微镜下观察时透明度大，折光性强(图1)。

耐药指数测定

通过MTT法测定RAJI/DOX对阿霉素的耐药指数(图2),其中RAJI亲本细胞对阿霉素非常敏感，IC50=396.59 nmol/L;RAJI/DOX1对阿霉素IC50=4033.92 nmol/L,耐药指数为9.1,为中度耐药；RAJI/DOX2对阿霉素IC50=7435.25 nmol/L,耐药指数为17.7,接近高度耐药。

耐药细胞RAJI/DOX、亲本细胞RAJI增殖情况

通过MTT法检测各组细胞的增殖变化，如图3所示，经统计分析，RAJI亲本细胞、RAJI/DOX1、RAJI/DOX2 3组细胞增殖变化无显著统计学差异(均P>0.05)。提示耐药细胞与亲本细胞RAJI生长无差别。

亲本细胞、耐药细胞膜糖蛋白Pgp表达情况

通过Western blot 测定亲本细胞RAJI,耐药细胞RAJI/DOX1、RAJI/DOX2三组细胞膜糖蛋Pgp表达。结果显示，RAJI/DOX1、RAJI/DOX2均明显表达Pgp, 在亲本细胞RAJI中的表达则极低，在RAJI/DOX2中的表达最高(图4)。经统计分析，RAJI细胞中PgP表达量为0.286±0.06,RAJI/DOX1细胞中为0.75±0.10,RAJI/DOX2细胞中为1.29±0.11,两两比较均有显著统计学差异(均P<0.001)。

NVP-BEZ235对耐药细胞p-AKT表达的影响

通过Western blot 测定亲本细胞RAJI,耐药细胞RAJI/DOX1、RAJI/DOX2、RAJI/DOX2-N中p-AKT(Thr308)的表达情况。统计分析结果显示，亲本细胞RAJI中p-AKT(Thr308)表达为0.63±0.01,RAJI/DOX1中为1.02±0.01,RAJI/DOX2中为1.36±0.01。RAJI/DOX2细胞中p-AKT的表达(Thr308)明显高于RAJI/DOX1细胞(P<0.001)及亲本细胞RAJI(P<0.001),RAJI/DOX1细胞高于亲本细胞RAJI(P<0.001)(图5)。提示，亲本细胞RAJI经诱导耐药后，AKT(Thr308)磷酸化水平明显上升，并与耐药程度相关。RAJI/DOX2细胞经NVP-BEZ235(100 nmol/L)培养12 h后，RAJI/DOX2-N组AKT(Thr308)明显下降(P<0.001),提示，NVP-BEZ235对高耐药RAJI/DOX2细胞具有明显抑制AKT(Thr308)磷酸化的作用。

NVP-BEZ235对耐药细胞p-mTOR表达的影响

通过Western blot 测定这4组细胞p-mTOR的表达情况(图6),结果与上述细胞p- AKT(Thr308)表达水平变化基本相似。亲本细胞RAJI经诱导耐药后，mTOR磷酸化水平明显上升，并且高度耐药细胞组高于中度耐药细胞组，中度耐药细胞组大于亲本细胞组；经统计分析，亲本细胞RAJI中p-mTOR表达为0.717±0.06,RAJI/DOX1中为0.89±0.03,RAJI/DOX2中为1.23±0.01,两两比较均有明显统计学差异(均P<0.001)。同时高度耐药细胞经NVP-BEZ235培养12 h后，RAJI/DOX2-N组mTOR磷酸化水平明显下降(为0.56±0.05),与RAJI/DOX2组比较有显著统计学差异(P<0.001)。

NVP-BEZ235、DOX单独及联合对RAJI/DOX2的生长抑制作用

如图7显示，NVP-BEZ235对RAJI/DOX2具有明显增殖抑制作用，并呈浓度依赖效应(r=0.912),DOX对RAJI/DOX2抑制作用较差，随DOX浓度升高，对高度耐药细胞的增殖抑制率仍呈一定的上升趋势(r=0.881)。经过随机区组设计方差分析多重比较，NVP-BEZ235组增殖抑制率明显高于DOX组(P<0.001)。NVP-BEZ235、DOX联合用药后，对RAJI/DOX2增殖抑制作用明显上升，高于NVP-BEZ235单药组(P<0.001)。提示，NVP-BEZ235对阿霉素耐药RAJI细胞具有逆转耐药作用。

三、讨论

化疗耐药是当前难治性淋巴瘤治疗的主要问题，大多数伯基特淋巴瘤对化疗药物敏感，但进展期伯基特淋巴瘤治疗效果欠佳，主要原因是其化疗耐药。Chumduri等[1]通过对经微管抑制因子化疗药物处理过的15种伯基特淋巴瘤细胞进行分析，认为化疗药物导致有丝分裂灾变引起多倍体形成可造成伯基特淋巴瘤化疗药物耐药。Farhat等[9]则认为，伯基特淋巴瘤耐药与P53基因突变有关，他们通过外源性激活p38 和JNK路径可诱导耐药细胞凋亡。BIM基因表达的失活也可能与伯基特淋巴瘤耐药有关，Richter-Larrea等[10]研究发现，与BIM基因正常表达患者相比，带有超甲基化及脱乙酰基BIM基因的伯基特淋巴瘤患者具有较低的化疗完全缓解率(24% vs 79%;P=0.002),更短的总生存期(P=0.007);进一步通过伯基特淋巴瘤移植瘤小鼠模型证实，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可逆转耐药。PI3K/AKT通道与肿瘤耐药的关系已有相关报道，Cavazzoni等[11]对诱导生成的来曲唑耐药的乳癌癌细胞株进行蛋白分析，发现耐药细胞株除了P-糖蛋白表达增加外，AKT、mTOR、P70S6K等PI3K/AKT/mTOR通道信号分子磷酸化水平明显上升。对吉非替尼耐药的小细胞肺癌细胞，Sun等[2]通过雷帕霉素抑制PI3K/AKT/mTOR通道进行研究，发现雷帕霉素能够逆转吉非替尼耐药，并在动物实验中得到证实。同时也有关NVP-BEZ235逆转肿瘤耐药的研究报道，Kim等[12]通过浓度梯度法获得两种耐硼替佐米套细胞淋巴瘤细胞株，该细胞株PI3K/AKT/mTOR通道活跃程度大于亲本细胞株，经NVP-BEZ抑制该通道信号后可逆转硼替佐米耐药。同样Yasumizu等[13]在体内、外通过NVP-BEZ235抑制PI3K/AKT/mTOR通道信号也能逆转前列腺癌多西他赛耐药。提示，PI3K/AKT/mTOR通道可能参与多药耐药的发生机制，抑制该通道可逆转化疗耐药，促进肿瘤凋亡。目前关于PI3K/AKT/mTOR通道信号与伯基特淋巴瘤耐药关系的研究较为少见。

本研究利用阿霉素诱导伯基特淋巴RAJI细胞成为耐阿霉素耐药细胞系。阿霉素系蒽环类抗肿瘤药物，为治疗伯基特淋巴瘤经典方案Hyper/CVAD里的组成药物之一，为周期非特异性抗肿瘤药物，对RNA、DNA均有抑制作用，抗肿瘤谱广泛，对多种血液肿瘤、实体瘤均有抗肿瘤作用，在肿瘤研究中常用来诱导建立多药耐药细胞系[14,15,16,17]。通过逐渐增加阿霉素浓度方法，即浓度梯度法，逐渐选择耐药细胞，经过9个月培养获得耐阿霉素RAJI细胞系[18]。按以往标准，耐药R因子>20为高度耐药，<5为低度耐药，耐药R因子在5-15之间为中度耐药[8]。本研究所诱导的RAJI/DOX1耐药细胞系的R因子为9.1,为中度耐药，RAJI/DOX2耐药细胞系的R因子为17.7,接近高度耐药，可满足伯基特淋巴瘤抗肿瘤药物耐药研究。

通过显微镜下观察，伯基特淋巴瘤细胞RAJI亲本细胞、耐药细胞在形态上无明显差别，镜下透明度大，折光性强，呈圆形，成团性强。通过MTT检测各组细胞增殖情况，经多重比较，RAJI、RAJI/DOX1、RAJI/DOX2各组细胞增殖均无明显差别(P>0.05),提示，耐药细胞与亲本细胞RAJI生长无明显差别。

肿瘤多药耐药性(multidrugresistanee, MDR)是指肿瘤细胞经一种化疗药物诱导耐药后，对其他几种结构及作用机制不同化学药物也产生耐药性的现象[19]。可能机制有，膜转运蛋白将细胞内药物排出细胞外；药物在细胞内代谢增强；药物作用位置改变和损伤靶点的修复增强；细胞凋亡抑制和细胞周期停滞。在这几种机制中，膜转运蛋白起主要作用，目前，研究最多的为ABC[20](ATP Bindingcasestte, ATP结合盒)型膜载体蛋白家族，包括P-糖蛋白(Pgp)[21]、多药耐药相关蛋白(MRP)[22]和乳癌耐药蛋白(BCRP)[23]等，其中P-糖蛋白(Pgp)是最具有代表性的一员，它的表达与细胞耐药呈相关性[24]。本研究通过Western blot 测定亲本细胞RAJI、耐药细胞RAJI/DOX1、RAJI/DOX2中膜糖蛋Pgp表达，结果显示，RAJI/DOX1、RAJI/DOX2均明显表达Pgp, 亲本细胞RAJI表达量则极低，RAJI/DOX2表达最高，其次为RAJI/DOX1,经过统计分析，三者之间均有明显差别(P<0.001),提示，细胞耐药指数与Pgp的表达具有正相关性，与之前的研究报道结果一致[21]。

文献报道，在多种耐药细胞中检测出PI3K/AKT/mTOR信号通道异常激活，虽其介导多药耐药的机制尚不明确，但抑制该通道后可逆转化疗药物耐药[1,2,3,4]。因此，本研究对耐药细胞的p-AKT、p-mTOR进行检测分析，结果显示，亲本细胞RAJI中p-AKT(Thr308)表达为0.63±0.01,RAJI/DOX1中为1.02±0.01,RAJI/DOX2中为1.36±0.01,经统计分析，RAJI/DOX2表达p-AKT(Thr308)明显高于RAJI/DOX1(P<0.001)及亲本细胞RAJI(P<0.001),RAJI/DOX1高于亲本细胞RAJI(P<0.001)。同AKT(Thr308)磷酸化水平检测，亲本细胞RAJI经诱导耐药后，mTOR磷酸化水平明显上升，并且高度耐药细胞高于中度耐药细胞，中度耐药细胞大于亲本细胞。提示，亲本细胞RAJI经诱导耐药后，PI3K/AKT/mTOR通道进一步激活，随着耐药指数的增加，通道的活化程度也随之提高。RAJI/DOX2细胞经NVP-BEZ235(100 nmol/L)培养12 h后，AKT(Thr308)、mTOR磷酸化水平明显下降，提示，NVP-BEZ235对高耐药RAJI/DOX2细胞具有明显抑制PI3K/AKT/mTOR通道的作用。本研究对NVP-BEZ235与DOX单药及联合用药进行了观察，DOX单药随着浓度的增加对RAJI/DOX2细胞增殖的抑制率也随着增加(r=0.881),但在临床中除了考虑化学药物对肿瘤细胞杀灭作用，还要考虑病人的耐受性，随着化疗剂量的增加，患者的化疗相关死亡率也会增加。NVP-BEZ235对RAJI/DOX2细胞增殖具有明显的抑制作用，当两药联合时，对RAJI/DOX2细胞增殖抑制作用明显上升，同NVP-BEZ235单药组相比具有明显统计学差别(P<0.001),提示，NVP-BEZ235对阿霉素耐药RAJI细胞具有耐药逆转作用。

综上所述，本研究成功诱导出耐阿霉素伯基特淋巴RAJI细胞系，发现PI3K/AKT/mTOR通道在耐药细胞系进一步活化，NVP-BEZ235对阿霉素耐药RAJI细胞具有耐药逆转作用，为耐药伯基特淋巴瘤治疗提供新思路及方向。

参考文献:

[5]李纯团,陈一峰,郑艳,等.PI3K-AKT-mTOR信号通路在伯基特淋巴瘤中的活化.白血病·淋巴瘤,2016,25(8):457-460.

[6]周伦欢,朱雄鹏,肖慧芳,等.mTOR抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞增殖抑制的研究.中国实验血液学杂志,2017,25(5):1397-1405.

基金资助:福建省自然科学基金项目(2022J011461);

文章来源:李纯团,朱雄鹏,王少雄,等.NVP-BEZ235逆转伯基特淋巴瘤RAJI细胞阿霉素耐药的研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):476-482.