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筛选具有抗限制性马拉色菌活性的中药和其活性成分分析

2020-07-21 385 上传者：管理员

摘要：目的筛选出具有抗限制性马拉色菌活性的中药及其活性成分。方法采用水煎煮法和95%乙醇加热回流提取法对中药进行提取;采用试管液基倍比稀释法进行中药提取物抗限制性马拉色菌的药敏实验,参照M27-A3方案中酵母菌微量稀释法测定其活性成分抗菌的药敏实验。结果在中药水提物中,MIC值由小到大,前三个分别为苍术(13.365±4.30) g/L、五倍子(18.021±8.87) g/L、丁香(18.831±4.43) g/L;95%乙醇提取物中,MIC值由小到大,前三个分别为虎杖(42.468±7.06) g/L、蒲公英(53.734±15.51) g/L、蛇床子(60.617±12.77) g/L;活性成分中,MIC值由小到大,分别为丁香酚(0.330±0.12)μL/mL、(1S)-(-)-ɑ-蒎烯(5.469±2.89)μg/mL、桉叶醇(625.0±104.17)μg/mL、黄岑苷(1 840±727.32)μg/mL、大黄素(1 875±703.13)μg/mL、木犀草素(3 187.5±0)μg/mL。结论对58个提取物样品和具有抗菌活性中药中的活性成分进行筛选,可得到具有较好抗限制性马拉色菌活性的中药及其活性成分,为脂溢性皮炎的治疗及中药去屑剂的开发提供有效的基础资料。

关键词：
中药
提取
筛选
药敏试验
限制性马拉色菌
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脂溢性皮炎是一种重要且常见的皮肤病,它的特点是头皮剥落和鳞屑,伴随着瘙痒和刺激;头皮屑是由头部表皮细胞新陈代谢产生的,头皮微环境的破坏,会使表皮细胞代谢发生紊乱,从而产生大量的头皮屑,影响日常生活与形象。限制性马拉色菌被认为是与脂溢性皮炎和头皮屑相关密切的机会性真菌[1,2]。研究表明,头皮屑的产生主要是由限制性马拉色菌、球形马拉色菌引起的[1,3,4],而限制性马拉色菌为主要的优势种属[5,6],它们能破坏头皮微环境,导致头部表皮细胞代谢紊乱,产生大量头皮屑,同时,限制性马拉色菌也是产生脂溢性皮炎的主要菌种[7]。因此,抑制限制性马拉色菌的生长、改善头皮微环境,是治疗头皮屑和脂溢性皮炎的关键。临床及去屑洗护用品中,最常使用的抗菌剂是酮康唑和吡啶硫酮锌(ZPT)[8,9]。这种抗菌剂长期使用会产生皮肤刺激、致敏、不稳定性等问题[10]。因此,筛选具有抑制限制性马拉色菌活性的植物提取物及活性成分,取代或部分取代化学抗菌剂成为目前研究的热点,并且具有较好的应用价值。

目前,国内外文献中,缺乏有关于大量中药提取物及活性成分抗限制性马拉色菌抑菌活性的报道。研究发现,苦参、香茅、蛇床子等中药对马拉色菌具有抑制作用,采用香柏波复方治疗脂溢性皮炎取得良好效果等,都表明中药可对马拉色菌产生抑制作用[11,12,13]。于是本研究从经典经方、文献报道及临床经验中选取了29种中药,进行了水提取和95%乙醇提取,测定该58个中药提取物抗限制性马拉色菌的MIC,筛选具有较好抑菌活性中药,并选取其活性成分,测定活性成分的抗限制性马拉色菌的MIC,从而筛选出抗菌活性良好的中药及其活性成分,为临床脂溢性皮炎治疗药物及洗护用品中去屑剂的研究开发提供理论参考依据。

1、实验部分

1.1材料、试剂及仪器

试菌株:CICC 33081限制性马拉色菌标准株(Malassezia restricta),均购自中国工业微生物菌种保藏中心。ATCC 2693改良Dixon培养基,批号:20190401,海博生物技术有限公司;2693改良Dixon(mDixon)培养基成分:麦芽浸膏36.0 g,牛胆粉20.0 g,蛋白胨6.0 g,甘油2.0 g,油酸2.0 g,水1 000 mL,吐温-40 10 mL调pH至6.0,固体培养基则加琼脂15 g。琼脂,Lot#:A1230A,CAS:9002-18-0,美仑生物科技有限公司;吐温40,CAS:S12702115,山东优索化工科技有限公司。29种中药分别为香茅、蔷薇花、连翘、虎杖、蒲公英、五倍子、无患子、苍术、薰衣草、紫苏、栀子、牛至、姜黄、升麻、苍耳、百里香、肉桂、薄荷、丁香、牡丹皮、蛇床子、两面针、香茶菜、侧柏叶、花椒、苦参、人参、甘草、马齿苋,均购自同仁堂药业;阳性药物为吡啶硫酮锌(ZPT),购自上海麦克林生化科技有限公司,CAS:13463-41-7;酮康唑,购自上海麦克林生化科技有限公司,CAS:65277-41-1。

6种活性成分均为抗菌活性较好的中药提取物中的成分,分别为木犀草素(蒲公英)(成都普思,98%);大黄素(虎杖)(成都普思,98%);丁香酚(丁香)(成都普思,95%);(1S)-(-)-ɑ-蒎烯(蛇床子)(成都普思,98%);β-桉叶醇(苍术)(成都普思,95%);黄岑苷(五倍子)(成都瑞芬思生物科技有限公司,98%);Lab-1A-80E冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;DHP-9052电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;SW-OJ-1F超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;XFS-280电热手提式压力蒸汽灭菌器,浙江新丰医疗器械有限公司;XSP-10C生物显微镜,上海永享光学仪器制造有限公司;FA2104上皿电子天平,上海精密科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1中药提取物的制备

中药水提取物的制备方法:称取每种中药各20 g,分别加入10倍量的纯化水,加热煎煮2 h,收集滤液,滤渣再加入8倍量的纯化水,加热煎煮1.5 h,合并滤液,纱网过滤,旋蒸浓缩,冷冻干燥成冻干粉,4℃冷藏备用。

中药95%乙醇提取物的制备:称取每种中草药各20 g,分别加入10倍量的95%乙醇,进行回流提取,加热煎煮2 h,收集滤液,滤渣再加入8倍量的95%乙醇,进行回流提取,加热煎煮1.5 h,合并滤液,纱网过滤,旋蒸浓缩,冷冻干燥成冻干粉,4℃ 冷藏备用。

1.2.2培养基的配制

称取66 g ATCC改良Dixon培养基,量取1 000 mL纯化水置于烧杯中混匀,搅拌均匀,并用l mol/L的盐酸溶液调整pH值至6.0,分装于250 mL锥形瓶中,用软胶塞塞口,用牛皮纸包扎,最后,进行121℃高压灭菌15 min,冷却后置于4℃冰箱备用。

1.2.3试管液基倍比稀释法测定中药提取物的MIC

药物的配制:称取各中药水提取及95%乙醇提物适量,用Tween-40∶水=1∶3体积比的混合溶液对样品进行超声波溶解30 min,制备500 g/L的高浓度药物原液,实验时,用液体培养基进行稀释。溶剂选择:采用V(Tween-40)∶V(水)=1∶3的混合溶液对中药提取物进行超声波溶解30 min。菌液的制备:挑取已转种活化的限制性马拉色菌受试菌,置于组织研磨器中,以无菌操作法加入无菌生理盐水,不断均匀研磨使菌丝断裂。将浊度调整为4号麦氏比浊管浊度,即菌液浓度为1.0×109～1.2×109 CFU/mL;实验时,用液体培养基将菌液稀释至1.0×106～1.2×106 CFU/mL。

体外抑菌活性测定:取12根试管,在1～10号试管中,分别加入1 mL培养液,第11、12号试管,加入2 mL培养液;取药液1 mL加入1号试管中,如香茅,使1号试管药液与培养液混合均匀,取1号试管混合液1 mL至2号试管,混合均匀,取2号试管混合液1 mL至3号试管,依此至10号试管,最后10号试管混合均匀后,弃去1 mL;分别取1 mL培养液置于1～10号试管中,使体积均为2 mL。可知,各试管药物浓度为1号试管125 g/L,2号试管为62.50 g/L,3号试管为31.25 g/L,4号试管为15.63 g/L,5号试管为7.81 g/L,6号试管为3.91 g/L,7号试管为1.95 g/L,8号试管为0.98 g/L,9号试管为0.49 g/L,10号试管为0.24 g/L,11号试管为加菌,不加药的生长对照,12号试管为含有250μL吐温-40做为空白对照;取50μL稀释过的菌液,分别加入1～11号试管中,混合均匀;将上述加样后的试管置于32℃ 培养箱,培养15～18 d。

1.2.4微量稀释法测定活性成分的MIC

采用美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)制定的M 27-A 3方案中微量稀释法,测定中药活性成分的抗限制性马拉色菌活性。①取96孔板,先从B 3～G 3纵列开始加入100μL的液体培养基,直至B 10～G 10列,B 11～G 11列加入200μL培养液作为空白对照孔。②取药物,用培养基进行稀释,取200μL稀释后药液,加入B 2孔,然后取100μL至B 3孔,混合均匀,取B 3孔100μL至B 4孔,依此类推,至B 9孔。③用培养液稀释菌液至1.0×106 CFU/mL,取100μL菌液加入B 3～B 10孔中。④分别加入250μL生理盐水至A 1～A 12孔,A 1～H 1孔,H 1～H 12孔,A 12～H 12孔,消除96孔板的边缘效应。⑤将上述96孔板置于32℃培养箱培养8 d,裸眼观察以抑制该菌生长的最小药物浓度作为MIC值。

1.3结果判读

经过32℃培养15～18 d后,取无肉眼可见菌落生长的最低药物浓度试管,即为该中药提取物的MIC;经过培养8 d后,取无肉眼可见菌落生长的最低药物浓度孔位,即为该中药活性成分的MIC。

1.4数据处理

对所有中药及其活性成分抑制限制性马拉色菌活性以MIC表示,数据采用Graphpad Prism 8进行分析,计量资料采用x¯±s表示,n=9;中药活性成分的两组间比较予以独立样本t检验,以P值大小表示差异是否具有统计学意义,0.01<P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示具有极显著性差异。

2、结果

2.1中药提取物的制备结果

结果显示采用水煎煮法对中药进行提取时,提取效率由高到低的前三种中药分别为五倍子(60.00%)、栀子(44.55%)、苍术(42.73%);采用95%乙醇加热回流对中药进行提取时,提取效率由高到低的前三种中药分别为五倍子(36.82%)、人参(24.82%)、栀子(18.45%),见表1。

2.2中药水提物及醇提物MIC测定结果

结果显示中药水提取对限制性马拉色菌均具有一定的抑菌作用,其中,中药水提物对限制性马拉色菌抑制活性较好的前三个分别为苍术(13.365±4.30) g/L、五倍子(18.021±8.87) g/L、丁香(18.831±4.43) g/L;而在中药95%乙醇提取物中,对限制性马拉色菌抑制活性较好的前三个分别为虎杖(42.468±7.06) g/L、蒲公英(53.734±15.51) g/L、蛇床子(60.617±12.77) g/L,见表2。

表1中药水提取物及95%乙醇提取物提取结果

表2中药水提物及95%乙醇提物MIC测定结果

2.3中药活性成分及阳性药MIC测定结果

结果显示具有良好抗限制性马拉色菌活性的中药活性成分是丁香酚和(1S)-(-)-ɑ-蒎烯,分别为丁香酚(0.330±0.116 )μL/mL及(1S)-(-)-ɑ-蒎烯(5.469±2.855)μg/mL;丁香酚、(1S)-(-)-ɑ-蒎烯与阳性药物吡啶硫酮锌和酮康唑相比,丁香酚的抗菌活性强于这两种阳性药,且差异具有统计学意义,(1S)-(-)-ɑ-蒎烯的抗菌活性比这两种阳性药差,且差异具有统计学意义,见表3。

表3中药活性成分抗限制性马拉色菌MIC测定结果及与阳性药的差异性比较

3、讨论

脂溢性皮炎和头皮屑的产生与限制性马拉色菌有非常关键且重要的联系。本实验通过对29种中药采用统一方法进行提取,并对提取所得到的58种中药提取物进行体外药敏实验,可筛选出抗限制性马拉色菌活性较好的中药,再通过微量稀释法测定其活性成分的抗菌活性,为中药资源在临床治疗脂溢性皮炎和去屑洗护用品中的应用提供依据和基础资料。

本实验分别采用了水和95%乙醇对中药进行了提取操作,分别得到不同的提取成分,根据不同方法的提取率可知,五倍子、栀子、苍术的水提取效率接近甚至超过50%,此类药材比较适合采用水提取;五倍子、人参的95%乙醇提取效率达到30%左右,此类药材可以采用95%乙醇提取;本实验采用常见的水和价格低廉的95%乙醇对中药进行提取,可得到不同溶解性质的有效抗菌成分,了解两种成分的抗菌作用的差异,且提取成本较低无有毒试剂,特别适合工业化生产。但是,本实验对具有抗限制性马拉色菌活性的中药进行了初步筛选,提取方式简单,后续工作者可继续设置水煎醇提组,抑或采用其他提取方法,以便更充分全面的将有效成分提取出来。

限制性马拉色菌是导致脂溢性皮炎和头皮屑的主要真菌;本实验结果表明,苍术、五倍子、丁香具有较好的抗限制性马拉色菌活性,其活性成分中,丁香酚的抑菌活性最好;丁香酚对限制性马拉色菌的抑菌活性强于阳性药物酮康唑和吡啶硫酮锌的抑菌活性,故可考虑将丁香酚用于临床治疗脂溢性皮炎;同时,丁香酚具有芳香气味,有望成为良好的去屑剂,用在洗发水中,将具有良好的市场前景;但是,应进一步研究丁香酚的刺激性以及如何降低其挥发性,以便更好的应用于实际。

本实验在筛选得到的苍术、五倍子、丁香等中药后,均只选取了该中药的一个活性成分,缺乏更广泛的中药活性成分对限制性马拉色菌的抑菌作用研究。故后续研究中,应选取更多的丁香、苍术、五倍子中的活性成分,测定它们的抑菌活性,为临床抗限制性马拉色菌提供更多潜在的药物。

同时,应当注意本实验属于初级研究,为后续研究治疗脂溢性皮炎药物和开发中药去屑剂提供基础资料,明确了具有抗菌活性的中药,避免后续研究的盲目性;应进一步探讨药物的刺激性、中药抗菌活性的物质基础、临床治疗效果等,为中药的临床应用和日用化学品领域的应用提供依据。

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基金:广东省科技厅应用型研发专项(2015B020234009);国家重点研发计划“中医药现代化”重点专项项目(2018YFC1707100).