骨质疏松症是一种常见的系统性骨骼疾病，其特征为骨量减少和骨组织结构恶化，可导致骨脆性增强和骨折风险增加[1]。成骨细胞在骨形成过程中发挥重要作用，主要负责骨基质的合成和骨组织的矿化。研究表明，成骨细胞和破骨细胞的骨稳态失衡是骨质疏松症发生的主要原因之一[2,3]。

中医学将骨质疏松症归属于“骨痿”“骨枯”“骨极”等范畴，并认为其病变部位虽在骨，但与肾、肝、脾三脏功能失调密切相关[4,5]。《素问·六节藏象论》记载：“肾者，主蜇，封藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨[6]。”即肾主管精气的封藏，人体之头发、骨骼均与血气盛衰有关，精气充沛则头发乌黑、骨骼强健。目前，治疗骨质疏松症的药物主要分为抗再吸收药物和合成代谢药物两大类[7],前者能减少骨吸收，后者可增加骨形成。临床上，以抗再吸收药物应用最为广泛，包括双磷酸盐(如阿仑磷酸盐、利塞磷酸盐、唑来磷酸、伊班磷酸盐、依替磷酸盐)、选择性雌激素受体调节剂(如雷洛昔芬)以及RANK配体抑制剂(如狄诺塞麦)。这些药物需长期服用，价格昂贵，且伴有副作用，因此临床应用具有一定的局限性[8]。

中医药具有天然性、低毒性、配伍灵活以及价格适中等优势[9],在骨质疏松症的治疗中逐渐受到关注。驻春胶囊由补骨脂、蛇床子、淫羊藿、枸杞子、肉苁蓉、延胡索、丹参、神曲、炒山楂等中药组成。其中，补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉共用可补肾阳、祛风湿，蛇床子具有温肾壮阳、燥湿祛风之效，神曲和炒山楂可健脾消食和胃，延胡索、丹参能活血止痛，诸药配伍，共奏补益肝肾、健脾坚骨之功。作为河南省洛阳正骨医院的院内制剂，驻春胶囊治疗骨质疏松症临床疗效显著，但其作用机制尚未明确。

miRNA是一类非编码小分子RNA,主要通过转录后调控机制影响靶基因表达，进而影响成骨细胞的增殖与分化[10,11]。本课题组前期研究证实，miR-935可调控成骨细胞分化[12,13],但其在骨质疏松症中的具体作用尚未明确。鉴于此，本研究旨在探讨驻春胶囊对小鼠前成骨细胞增殖与分化的影响，并分析miR-935在此过程中的作用及其潜在机制。

1、材料

1.1 细胞

MC3T3-E1细胞，即小鼠胚胎成骨细胞前体细胞，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号：ZQ0095,传至第3代进行后续研究。

1.2 药物与试剂

驻春胶囊(河南省洛阳正骨医院院内制剂，批号：豫药制字Z20120249);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)抗体、骨钙素(osteocalcin, OCN)抗体、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)抗体、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)抗体(Affinity公司，货号：BF0179、DF12303、AF5186、AF6300);β-Actin抗体(Proteintech公司，货号：81115-1-RR);HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen公司，货号：C31460100、C31430100);α-men培养基、CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒、RIPA裂解液、PEI 40K Transfection Reagent(Servicebio公司，货号：G4555-500ML、G4103-1ML、G2002-30ML、G1802-10ML);胎牛血清、青链霉素混合液(美国Gibco公司，货号：10091-148、15070-063);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010);蛋白marker(VAZYME公司，货号：MD102-01);OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成骨诱导分化试剂盒(奥瑞生物，货号：MUXMT-90021);Trizol(Ambion公司，货号：15596026);胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)不含酚红、4%多聚甲醛组织细胞固定液(索莱宝公司，货号：T1300、P1110)。

1.3 仪器设备

凝胶成像仪(武汉佰法生物科技有限公司，型号：GD50102);超净工作台(美国AIRTECH公司，型号：SW-CJ-1F);CO2培养箱(美国Thermo公司，型号：Midi 40);酶标板自动读数仪、蛋白电泳仪、FX96实时定量荧光PCR仪(美国BIO-RAD公司，型号：1681130、164-5050、1852148);低速离心机(德国Eppendorf公司，型号：5702R);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG 9203A);倒置显微镜(日本 OLYMPUS 公司，型号：IX51)。

2、方法

2.1 CCK-8法检测驻春胶囊的细胞毒性

将1 200 mg驻春胶囊溶解于6 mL DMSO中，配置质量浓度为200 g·L-1的驻春胶囊储备液。使用α-mem完全培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素),将MC3T3-E1细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。使用0.25%胰蛋白酶消化MC3T3-E1细胞，以5×103个的密度接种于96孔板中。待细胞贴壁后，分别加入质量浓度为100 000 mg·L-1、50 000 mg·L-1、25 000 mg·L-1、12 500 mg·L-1、6 250 mg·L-1、3 125 mg·L-1、1 562.5 mg·L-1、781.25 mg·L-1、390.625 mg·L-1、195.312 5 mg·L-1、97.656 25 mg·L-1、48.828 13 mg·L-1、24.414 06 mg·L-1、12.207 03 mg·L-1、6.103 516 mg·L-1、3.051 758 mg·L-1、1.525 879 mg·L-1、0.762 939 5 mg·L-1的驻春胶囊溶液100 μL,培养48 h后，每孔加入CCK-8工作液10 μL,37 ℃避光孵育1 h, 用酶标仪测定各孔吸光度值，每组设置6个复孔。采用Graphpad Prism软件分析数据，并绘制半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)曲线图。将细胞分为正常对照组和驻春胶囊组，检测miR-935 mRNA表达水平。

2.2 茜素红染色观察细胞成骨诱导情况

取MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，细胞密度为2×104 cm-2,分为无诱导组、诱导组、诱导+驻春胶囊组、无诱导+驻春胶囊组。当细胞融合度达70%时，吸弃原培养基，并根据成骨诱导试剂盒说明书，诱导组和诱导+驻春胶囊组细胞加入2 mL成骨诱导培养基。每隔3 d换液1次，诱导14 d、21 d后，吸去6孔板中的成骨诱导培养基，PBS清洗2～3次；每孔加入4%多聚甲醛溶液2 mL,室温固定30 min; 吸去固定液，PBS清洗2～3次，以清除固定液；每孔加入2 mL茜素红工作液，室温染色5～10 min; 吸去茜素红染色液，PBS清洗2～3次，显微镜下观察成骨细胞诱导情况。

2.3 miR-935转染成骨细胞

成骨诱导的MC3T3-E1细胞经驻春胶囊干预后，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，取汇合率为80%的对数生长期细胞接种于6孔板中。将细胞分为miR-935 inhibitor(抑制组)和inhibitor NC(阴性对照组),按照PEI 40K Transfection Reagent说明书的步骤转染miR-935 inhibitor和inhibitor NC,转染72 h后更换为正常培养基，用于后续实验。

2.4 qRT-PCR检测细胞miR-935、STAT1、Runx2、ALP、OCN基因表达水平

实验分组同2.2、2.3,收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒步骤提取细胞RNA,并按照逆转录试剂盒步骤获取 cDNA。配置反应体系：cDNA 3 μL,5×BlazeTaq qRT-PCR Mix 5 μL,正向引物1 μL,反向引物 1 μL,ddH2O 10 μL;上机条件：25 ℃ 5 min, 50 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, -80 ℃冰箱中保存备用。采用实时荧光定量PCR仪进行扩增，扩增条件为：预变性95 ℃ 1 min, 变性95 ℃ 20 s, 退火55 ℃ 20 s, 延伸72 ℃ 30 s, 40个循环。实验结束后，读取Ct值，用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。以GAPDH或U6作为内参基因，引物序列见表1,引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

2.5 Western blot检测细胞ALP、OCN、RUNX2、STAT1蛋白表达水平

实验分组同2.2、2.3,收集各组细胞，分别加入100 μL RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min, 取上清，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，按照比例加入SDS-PAGE蛋白缓冲液，煮沸5 min, 立即分装，置于-20 ℃冰箱中备用。取50 μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，封闭，一抗(稀释比例为1:1 000)4 ℃孵育过夜。使用TBST充分洗涤3次，每次10 min。二抗(稀释比例为1:5 000)室温孵育2 h。TBST再次洗涤3次，每次10 min。ECL发光液显影曝光，用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，并计算目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

采用GraphPad Prism软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示。若数据符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；若数据不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 驻春胶囊对MC3T3-E1细胞的毒性作用

采用CCK-8法检测驻春胶囊对MC3T3-E1细胞的EC50值为 4 684 mg·L-1,并以此作为后续实验驻春胶囊干预细胞的最佳浓度，见图1。

图1 驻春胶囊对MC3T3-E1细胞的毒性作用   

3.2 驻春胶囊对MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响

茜素红染色结果显示，与无诱导组比较，诱导组、诱导+驻春胶囊组、无诱导+驻春胶囊组细胞均可见不同程度的红色结节和钙沉积。由此表明，MC3T3-E1细胞已成功诱导为成骨细胞，且驻春胶囊可促进MC3T3-E1细胞的成骨增殖与分化，见图2。

图2 各组细胞茜素红染色图(×100)   

3.3 驻春胶囊对细胞ALP、RUNX2、OCN、STAT1、miR-935基因和蛋白表达水平的影响

qRT-PCR结果显示，诱导14 d时，与无诱导组比较，诱导组细胞的ALP mRNA、RUNX2 mRNA、OCN mRNA、miR-935 mRNA水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.05),无诱导+驻春胶囊组细胞的ALP mRNA、RUNX2 mRNA水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.05)。与诱导组比较，诱导+驻春胶囊组细胞的RUNX2 mRNA、OCN mRNA、miR-935 mRNA水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.05)。诱导21 d时，与无诱导组比较，诱导组细胞的ALP mRNA、RUNX2 mRNA、OCN mRNA、miR-935 mRNA 水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.05),无诱导+驻春胶囊组细胞的miR-935 mRNA 水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.01)。与诱导组比较，诱导+驻春胶囊组细胞的ALP mRNA、RUNX2 mRNA、OCN mRNA水平升高，STAT1 mRNA水平降低(P<0.05),见图3。

图3 各组细胞ALP、RUNX2、OCN、STAT1、miR-935基因表达水平比较   

图4 各组细胞ALP、OCN、RUNX2、STAT1蛋白表达水平比较  

3.4 驻春胶囊通过调控miR-935对细胞成骨分化的影响

qRT-PCR结果显示，与正常对照组比较，驻春胶囊组细胞miR-935 mRNA水平升高(P<0.01),见图5A。与inhibitor NC组比较，miR-935 inhibitor组细胞OCN mRNA、ALP mRNA、miR-935 mRNA水平降低，STAT1 mRNA水平升高(P<0.05),见图5B。

WB结果显示，与inhibitor NC组比较，miR-935 inhibitor组细胞OCN、ALP蛋白表达水平降低，STAT1蛋白表达水平升高(P<0.05),见图5C。

图5 各组细胞miR-935、STAT1、OCN、ALP基因和蛋白表达水平比较   

4、讨论

骨质疏松症是绝经后女性常见的疾病类型，其主要特征为骨密度和机械强度降低，进而导致骨脆性增加[14,15]。据欧洲的统计数据显示，大约19%的男性和30%的女性面临罹患骨质疏松症的风险，且每年约有900万例与骨质疏松症相关的骨折事件发生[16]。研究表明，骨稳态失衡导致的骨形成减少是引发骨质疏松症的主要因素之一。随着年龄增长，成骨细胞作为骨形成过程中的关键细胞，其数量和功能下降是导致骨形成受损的主要原因之一[17,18]。

中医学认为，骨质疏松症的病机主要在于肝肾亏虚。驻春胶囊具有补益肝肾、健脾坚骨之功，用于治疗由骨质疏松引起的腰背腿痛、酸沉无力、骨质退化等症状，临床疗效确切[19,20]。研究表明，驻春胶囊可增加患者血清中钙、骨钙素含量，降低酒石酸酸性磷酸酶5b含量，从而提高成骨细胞活性、抑制破骨细胞功能以及改善骨代谢状况[21]。本研究表明，驻春胶囊能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。

miRNA在调节成骨细胞与破骨细胞功能中发挥重要作用，特定miRNA分子可靶向结合成骨相关因子，从而抑制成骨细胞分化。因此，在部分骨病的治疗中，调节miRNA表达水平具有潜在的治疗意义。本课题组前期研究发现，在人成骨细胞系(hFOB1.19)中，miR-935表达显著上调[13],因此被选为后续实验研究的目标。研究显示，经miR-935修饰的骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以下调STAT1表达，从而促进成骨细胞的分化和增殖。

本研究发现，驻春胶囊可显著提高成骨相关因子ALP、OCN、RUNX2和miR-935的表达水平。ALP作为成骨细胞活性标志物，是成骨细胞表型与分化的特征性蛋白质产物。ALP可在碱性条件下分解有机磷脂，提供磷酸根，去除钙化抑制物，从而促进骨钙化进程，并参与骨代谢等生理活动[22]。OCN是一种含46～50个氨基酸的可分泌蛋白，主要由成骨细胞产生，常作为成骨细胞骨形成的血清生物标志物[23,24]。Runx2是Runt家族的核心成员之一，在人类与小鼠的成骨细胞和软骨细胞分化中发挥重要作用[25]。信号传导与转录激活蛋白(STATs)构成了一种独特的蛋白质家族，其可与DNA结合。研究表明，牙髓干细胞通过抑制STAT1表达，有效缓解进行性颞下颌关节炎的症状[26]。骨质疏松症发病机制的研究表明，STAT1可被IFN-β诱导表达[27,28]。Kim等[29]发现，STAT1与Runx2在细胞质中相互作用，从而抑制Runx2的核定位。此外，STAT1上调显著抑制Runx2的核易位和miR-194过表达介导的成骨细胞分化[30]。本研究通过细胞功能恢复实验发现，驻春胶囊+miR-935 inhibitor组的ALP、OCN、miR-935表达水平显著增加，同时STAT1表达水平降低，与前期研究一致。

综上所述，驻春胶囊通过调控miR-935促进成骨细胞分化，其机制可能与影响STAT1、RUNX2、ALP和OCN的表达有关。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81774348,81874477);河南省卫生健康中青年学科带头人资助项目(HNSWJW-2020028);河南省科技攻关项目(202102310152);

文章来源:张宁,董一平,刘曼,等.驻春胶囊通过调控miR-935促进成骨细胞分化的机制[J].中医学报,2024,39(06):1131-1137.