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HIV感染急性期治疗对α4β7肠道归巢CD4细胞保护作用的研究

2024-02-04 14 上传者：管理员

摘要：目的探讨HIV感染急性期ART对α4β7肠道归巢CD4细胞及其功能亚群的保护作用。方法入组HIV感染急性期(AHI)cART患者71名、慢性期(CHI)cART患者29名和HIV抗体阴性健康对照者(HC)32名。采用流式分析方法，分别检测HC、AHI和CHI在cART基线(0周)、24周、48周和96周α4β7CD4细胞及其功能亚群α4β7Treg、α4β7Th1和α4β7Th17比例；HC、AHI和CHI 0周和96周CD38+HLA-DR+CD8细胞比例。ELISA检测HC、AHI和CHI 0周和96周血浆可溶性CD14(sCD14)浓度。结果与HC相比，AHI和CHI α4β7CD4细胞比例在0周均显著下降[AHIvs.HC:(8.214±3.074)vs.(10.027±2.617),P<0.010;CHIvs.HC:(7.290±2.295)vs.(10.027±2.617),P<0.010]。cART 96周后，AHI和CHI α4β7CD4细胞比例仍显著低于HC。AHI 0周和96周α4β7Th17细胞比例与HC差异无统计学意义。不同基线CD4细胞数量开展AHI cART过程中，α4β7Th17细胞比例差异均无统计学意义，且0周α4β7Th17细胞比例与0周和cART 96周血浆sCD14浓度(0周：r=-0.310,P=0.018;96周：r=-0.270,P=0.039)、0周CD38+HLA-DR+CD8细胞比例(r=-0.279,P=0.042)负相关。结论开展急性期cART可以有效保护α4β7CD4细胞亚群α4β7Th17细胞。

关键词：
Th17
α4β7
急性期治疗
肠道归巢
艾滋病病毒
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HIV侵入机体后首先感染肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue,GALT）中的CD4细胞，CD4细胞大量丢失，继而导致肠黏膜完整性破坏，肠道微生物进入血液，引发慢性免疫活化和炎症[1]。肠道归巢细胞是CD4细胞的一个亚群，表达归巢受体整合素α4β7，具有记忆表型，其配体为存在于肠系膜淋巴结高内皮静脉和肠固有层的黏膜地址素细胞黏附分子（mucosal addressin cell adhesion molecule,MAd CAM）。α4β7与MAd CAM结合，引导外周血CD4细胞归巢至肠道，发挥免疫功能[2]。

另一方面，α4β7CD4细胞高表达HIV辅受体CCR5，且HIV gp120 V2环的一段保守序列与MAd CAM的序列极其相似，导致α4β7CD4细胞更容易被HIV感染[3,4]。归巢至肠道的被感染的α4β7CD4细胞能够向肠道输送HIV，加重肠道感染，成为HIV致病机制之一，有效阻止或降低HIV感染α4β7CD4细胞，可能会对HIV致病及维持肠道免疫功能有重要作用。

研究表明，在HIV感染慢性期开展c ART并不能完全恢复α4β7CD4细胞的数量和功能[5,6]。前期研究发现，HIV感染急性期阶段，α4β7CD4细胞就已大量减少且功能亚群紊乱[7]。因此，本研究利用急性期治疗队列分析HIV感染急性期c ART过程中α4β7CD4细胞及其功能亚群α4β7Treg、α4β7Th1和α4β7Th17的动态变化及与慢性免疫活化的关系，从而探讨急性期c ART对α4β7CD4细胞的保护作用。

1、对象与方法

1.1 研究对象

本研究所纳入的研究对象均来源于2014-2017年入组首都医科大学附属北京佑安医院HIV感染急性期（acute HIV infection,AHI）和慢性期（chronic HIV infection,CHI）治疗队列的HIV感染者。调查对象来自男男性行为高危筛查人群，每2个月进行一次筛查，如本次检测符合以下要求，即可判为AHI并纳入AHI治疗队列：1)ELISA结果为阴性；2）以下满足其一：HIV蛋白印迹试验少于三条带、HIV p24检测阳性、HIV RNA阳性。CHI判定标准为抗HIV抗体阳性6个月以上。年龄为18～65岁，均排除严重肝肾疾病、结核、HBV、HCV及梅毒感染。同时本研究从男男性行为高危筛查队列中选取与HIV感染者年龄匹配的HIV抗体阴性健康对照（healthy control,HC)32名。研究对象入组时均签署知情同意书，研究方案已通过北京佑安医院伦理委员会批准（京佑伦科字[2020]124号）。

1.2 方法

研究对象分组及样本采集方法：AHI治疗患者71名，采用TDF+3TC+EFV或TDF+3TC+LPV/r治疗方案。根据c ART基线（0周）CD4细胞数量，AHI分为3组：A350(CD4细胞数量<350个/µL,n=30）、A350～500(CD4细胞数量在350～500个/µL之间，n=23）和A500(CD4细胞数量>500个/µL,n=18）。CHI治疗患者29名，采用AZT+3TC+NVP或AZT+3TC+EFV治疗方案。HIV感染者于c ART 0周、24周、48周和96周采集抗凝血进行CD4细胞和病毒载量检测，并分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）和血浆进行冻存。

细胞表型染色：冻存PBMC复苏后进行细胞计数，106个PBMC用死/活细胞染料和荧光标记小鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD45RA、β7、CD38和HLA-DR单克隆抗体进行表面染色，室温避光孵育15 min后PBS洗涤2次。利用foxp3/transcription factor staining buffer set（美国e Bioscience公司）对细胞进行固定破核后，按照说明书要求加入foxp3单克隆抗体进行染色。PBS洗涤2次后，加入200µL 2%多聚甲醛进行固定，用BD FACSCanto II流式细胞仪（美国BD公司）收集数据，Flowjo10.8.1软件进行数据分析。以上所用抗体均购自BD公司或美国Biolegend公司。由于95%以上β7+CD45RA-CD4细胞表达α4，故本研究将CD3+CD4+CD45RA-β7+定义为α4β7CD4细胞。foxp3+α4β7CD4细胞定义为α4β7Treg细胞。

细胞功能检测：106个PBMC加入leukocyte activation cocktail(PMA/Iononmycin/Brefeldin A,BD公司）进行刺激，同时设置不加上述刺激物的阴性对照，37℃，5%CO2孵育。5 h后，收集细胞并用PBS洗涤。随后加入荧光标记小鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD45RA、β7单克隆抗体进行表面染色，室温避光孵育15 min后PBS洗涤2次。利用BD cytofix/cytopermfixation/permeabilization solution试剂盒（BD公司）进行细胞破膜，按照说明书要求加入抗人IFN-γ和IL-17A单克隆抗体进行胞内染色。PBS洗涤2次后，加入200µL 2%多聚甲醛进行固定，用BD FACSCanto II流式细胞仪收集数据，Flowjo10.8.1软件进行数据分析。以上所用抗体均购自BD或Biolegend公司。IFN-γ+α4β7CD4细胞定义为α4β7Th1细胞，IL-17A+α4β7CD4细胞定义为α4β7Th17细胞。

血浆s CD14浓度检测：应用human CD14 Duoset ELISA试剂盒（美国R&D公司）进行检测。

CD4细胞数量和血浆HIV病毒载量检测：抗凝血采用BD公司Tru Count计数管和CD3/CD4/CD8/CD45多色流式混合抗体进行细胞染色，流式细胞仪检测，Multiset软件自动计算CD4细胞数量。美国雅培Real-time HIV-1 m2000系统检测血浆HIV病毒载量，检测下限为40拷贝/m L。

1.3 统计分析

计量资料以描述。两变量间比较符合正态分布的数据采用t检验，不符合正态分布的数据采用Mann Whitney检验，两变量间相关性分析采用Spearman相关法。P<0.050为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 研究对象一般资料分析

HC、AHI和CHI组研究对象年龄匹配。A350、A350～500、A500和CHI血浆病毒载量在c ART基线（0周）时差异无统计学意义。CD4细胞数量方面，A350、A350～500和CHI在0周时显著低于HC(P<0.050),c ART 96周后，A350和CHI仍显著低于HC(P<0.050）。见表1。

表1 研究对象基本信息

2.2 α4β7CD4细胞及其功能亚群在c ART过程中的动态变化分析

α4β7CD4细胞及其功能亚群在c ART过程中的比例统计分析结果见表2。如图1A所示，0周时，与HC相比，AHI和CHI α4β7CD4细胞比例均显著减少（P<0.050），且AHI α4β7CD4细胞比例显著高于CHI(P<0.050）。不论AHI或CHI,c ART24周、48周和96周时α4β7CD4细胞比例均无显著变化且显著低于HC(P<0.050）。

功能亚群方面，AHI或CHI α4β7Treg细胞比例在0周时均显著高于HC(P<0.050），且CHI 0周α4β7Treg细胞比例显著高于AHI(P<0.050）（图1B）。不论AHI或CHI,c ART 24周、48周和96周时，α4β7Treg细胞比例差异均无统计学意义且显著高于HC(P<0.050）。0周时，AHI与HC的α4β7Th17细胞比例差异无统计学意义，CHI α4β7Th17细胞比例显著低于AHI(P<0.050），但与HC差异无统计学意义（图1C）。c ART过程中，AHI α4β7Th17细胞比例无显著变化，但CHI α4β7Th17细胞比例逐渐下降，c ART 96周后显著低于AHI(P<0.050）。AHI或CHI α4β7Th1细胞比例在0周及c ART 96周后均显著低于HC，且AHIα4β7Th1细胞比例均显著高于CHI(P<0.050，图1D）。

2.3不同CD4细胞数量基线开展HIV感染急性期c ART α4β7CD4细胞及其功能亚群的动态变化分析

AHI分层分析结果见表3。如图2,A350组α4β7CD4细胞比例在0周、24周、48周均显著高于A350～500和A500组，96周A350组显著高于A500组（图2A,P<0.050）。

表2 α4β7CD4细胞及其功能亚群比例统计分析结果

图1 α4β7CD4细胞及其功能亚群比例在不同组间的比较

功能亚群方面，3组α4β7Treg细胞比例在治疗过程中均无明显变化且始终高于HC（图2B）。α4β7Th17细胞比例在3组间差异无统计学意义，且与HC差异也无统计学意义（图2C）。3组α4β7Th1细胞比例在治疗过程中始终低于HC(P<0.050），但3组间差异无统计学意义（图2D）。

2.4 HIV感染急性期α4β7Th17细胞比例与CD8细胞活化和血浆s CD14浓度的相关性分析

CD8细胞活化水平由CD38和HLA-DR共表达比例表示。各组CD8细胞活化和血浆s CD14浓度统计分析结果见表4。如图3A所示，0周时，3组AHI的CD38+HLA-DR+CD8细胞比例均显著高于HC(P<0.050）。96周时，3组CD38+HLA-DR+CD8细胞比例均显著下降且与HC差异无统计学意义，三组间差异也无统计学意义。

表3 不同CD4基线AHI在ART过程中α4β7CD4细胞及其功能亚群比例统计分析结果

图2 HIV感染急性期治疗α4β7CD4细胞及其功能亚群比例在治疗基线不同CD4细胞数量组间的比较

A500组血浆s CD14浓度在0周时与HC差异无统计学意义，而A350组血浆s CD14浓度在0周和96周显著高于HC (P<0.050）（图3B）。

图3 HIV感染急性期治疗CD8细胞活化水平和血浆s CD14浓度在治疗基线不同CD4细胞数量组间的比较

相关性分析发现，AHI 0周α4β7Th17细胞比例与0周血浆s CD14浓度（r=-0.310,P=0.018，图4A）和0周CD38+HLA-DR+CD8细胞比例（r=-0.279,P=0.042，图4B）负相关，与AHI c ART 96周时血浆s CD14浓度（r=-0.270,P=0.039，图4C）负相关。

3、讨论

与慢性期治疗相比，急性期治疗在提高免疫重建、降低机体免疫活化和病毒储藏库水平方面彰显益处[8,9,10]。本研究发现，急性期治疗也不能恢复α4β7CD4细胞的比例（图1A），说明在感染早期α4β7CD4细胞就被HIV感染。多项研究报道，较高比例的α4β7CD4细胞与HIV感染者CD4细胞快速丢失及免疫重建不良有关[11,12,13]。本研究对HIV感染急性期治疗患者进行分组分析发现，A350组在治疗基线α4β7CD4细胞比例最高，但随着治疗时间的延长，其比例逐渐下降，A350～500和A500两组α4β7CD4细胞的比例在c ART前后无显著变化（图2A），也提示A350组在治疗基线虽然有更高的α4β7CD4细胞比例，但可能导致被HIV感染的α4β7CD4细胞更多，即使进行急性期c ART也不能阻止细胞由于被HIV感染导致的死亡。

表4 不同CD4细胞基线AHI在ART过程中CD8细胞活化水平和血浆s CD14浓度统计分析结果

图4 HIV感染急性期治疗α4β7Th17细胞与CD8细胞活化水平和血浆s CD14浓度的相关性分析

功能亚群方面，本研究发现，相较于慢性期c ART，开展急性期c ART可有效保护α4β7Th17分泌IL-17的功能（图1C），且在不同CD4细胞数量治疗基线组中均具有相似的保护作用（图2C）。其他研究也报道，急性期c ART不仅能够有效阻止肠道黏膜Th17细胞的丢失，维持其正常功能，还可以恢复血液Th17细胞数量，最终完全逆转机体慢性免疫活化[14,15]。以上报道及本研究结果都说明急性期c ART对保护Th17细胞的重要性。s CD14可以作为肠道细菌易位的标志物，CD8细胞的高度活化也可以由肠道微生物进入血液引起[16]。本研究发现在急性期c ART后，两个指标均显著下降，但只有A350组CD8细胞活化水平和血浆s CD14浓度没有下降至正常水平（图3A和3B）。由于通过高危筛查策略发现HIV感染6个月内均为急性期，此结果说明CD4细胞在350个/µL以上开展治疗具有更大的益处，进一步强调了早筛查早治疗的重要性。此外，本研究的相关性分析结果也提示α4β7Th17细胞归巢至肠道后对肠黏膜完整性的保护作用。

本研究虽然观察到急性期c ART可以维持α4β7Th17细胞分泌IL-17的功能，但仍需要通过肠道组织样本分析以及动物攻毒实验进一步验证急性期c ART对α4β7Th17细胞的保护作用。

综上，急性期c ART虽然不能恢复α4β7CD4细胞的比例，但可以有效保护其亚群α4β7Th17细胞分泌IL-17的功能，有助于维持肠道黏膜完整性及发挥肠道免疫功能。

基金资助:北京市教育委员会科学研究计划项目资助(KM202010025015);北京市卫生健康委员会高层次公共卫生技术人才建设项目资助(学科骨干-02-21);首都医科大学附属北京佑安医院中青年人才培养计划专项经费资助(YARCKB2022002);艾滋病研究北京市重点实验室(BZ0089)~~;

文章来源:王蕊,计云霞,陆小凡.HIV感染急性期治疗对α4β7肠道归巢CD4细胞保护作用的研究[J].中国艾滋病性病,2024,30(01):1-7.