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HIV/AIDS患者口腔菌群多样性和菌群分布特点分析

2024-03-28 106 上传者：管理员

摘要：目的探讨HIV/AIDS患者和非HIV感染者口腔菌群多样性和菌群分布特征的差异。方法纳入2023年1-12月佛山市顺德区第五人民医院和广州医科大学附属市八医院门诊或住院的HIV/AIDS患者和非HIV感染者，收集其非刺激性唾液样本，使用Illumina Hiseq2500平台（PE250模式）对唾液样本菌群的16S rDNA V3～4基因片段进行测序，并使用生物信息学进行口腔菌群多样性和口腔菌群的差异分析。结果本研究共纳入30例HIV/AIDS患者（HIV感染组）和28非HIV感染者（非HIV感染组），两组的一般资料（年龄、性别、吸烟和饮酒的构成比）差异无统计学意义（P均>0.05）。在门水平，HIV感染组Alpha多样性（Ace,Shannon和Simpson指数）显著高于非HIV感染组[16.0(9.0,19.3)vs. 7.0(0.0,14.0),1.44(1.34,1.52)vs. 1.36(1.28,1.40),0.28(0.25,0.33)vs. 0.31(0.30,0.36),P均<0.05]；在属水平，HIV感染组Alpha多样性也显著高于非HIV感染组[108.0(61.0,167.0)vs. 61.0(55.0,93.0),2.52(2.34,2.65)vs.2.35(2.24,2.46),0.14(0.11,0.17)vs. 0.16(0.15,0.21),P均<0.05]。在门水平相对丰度前10的菌群中，拟杆菌门（Bacteroidota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）在HIV感染组的丰度显著高于非HIV感染组（P均<0.05），但厚壁菌门（Firmicutes）在HIV感染组的丰度显著低于非HIV感染组（P=0.015）。在属水平相对丰度前15的菌群中，链球菌属（Streptococcus）、罗斯菌（Rothia）和孪生球菌属（Gemella）在HIV感染组显著低于非HIV感染组（P均<0.05），但普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉菌属（Porphyromonas）、韦荣球菌属（Veillonella）和拟普雷沃菌属（Alloprevotella）在HIV感染组显著高于非HIV感染组（P均<0.05）。结论 HIV/AIDS患者口腔菌群多样性高于非HIV感染组，HIV感染可能导致口腔菌群失调。

关键词：
HIV感染
免疫功能
口腔菌群
艾滋病病毒
菌群多样性
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HIV感染可导致机体天然免疫和体液免疫功能显著下降，从而导致各种机会性感染的发生，增加患者死亡的风险[1,2]。口腔是HIV感染所致机会性感染和相关疾病发生的重要器官之一，HIV感染可明显增加口腔疾病的发生，其中30%～80%的HIV感染者存在HIV相关的口腔疾病[3]，可能与HIV/AIDS患者口腔菌群失调、全身和口腔局部黏膜免疫异常等因素有关，其中患者口腔菌群失调可能是重要的原因之一。国外曾对HIV/AIDS患者口腔菌群的特征进行研究[4,5]，但口腔菌群在不同人群的特点可能并不一致，本研究拟对国内HIV/AIDS患者口腔菌群进行研究，阐述其特点。

1、对象与方法

1.1对象

选择2023年1-12月佛山市顺德区第五人民医院和广州医科大学附属市八医院符合入排标准门诊或住院的HIV/AIDS患者（HIV感染组）和非HIV感染者（非HIV感染组）进行研究。研究对象的纳入标准：1)HIV/AIDS患者的诊断符合《中国艾滋病诊疗指南》的诊断标准[3]，非HIV感染者的纳入标准为HIV抗体初筛试验阴性；2）纳入的HIV感染和非HIV感染者3个月内未使用抗生素。排除标准：无法配合常规口腔检查的人群。所有调查对象均签署知情同意书，本研究经佛山市顺德区第五人民医院伦理委员会批准（编号：2023-95）。

1.2方法

HIV/AIDS患者和HIV非感染者在上午9:00-11:00收集非刺激性唾液样本2 m L，收集的样本放置-80℃超低温冰箱保存。

1.2.1唾液样本细菌16S r DNA检测方法

使用CTAB/SDS法对样本的唾液样本总DNA进行提取，并将提取的DNA样本稀释至1 ng/μL的浓度备用。唾液样本细菌16S r DNA V3-4区基因扩增使用文献报道的通用引物[6]，引物的具体序列如下：341F:5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3',806R:5'-GGAC-TACNNGGGTATCTAAT-3'，双侧引物加入已知核酸序列的分子标签，用于各样本测序数据的分离。使用Phusion高保真DNA聚合酶（NEB公司，美国）进行扩增，扩增的条件如下：98℃预变性1 min;98℃10 s,55℃30 s,72℃30 s,30个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用试剂盒（QIAGEN公司，德国）对PCR产物进行胶回收，按每个样本10 ng的DNA量进行混样。混样后的DNA样本使用Tru Seq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒（Illumina公司，美国）进行DNA文库构建，使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent公司，美国）进行DNA文库的质量评估，评估合格的DNA文库使用Illumina Hiseq2500平台，PE250模式进行测序。

1.2.2测序数据分析

二代测序的原始数据使用FASTX Toolkit软件进行过滤，剔除低质量分数的reads(Q30<80%）。应用Geneious R11.1.5软件根据预设的分子标签进行各样本的数据分离。分离后的样本数据使用FLASH V1.2.7软件进行序列拼接。拼接后的数据使用Qiime2流程进行测序数据分析[7]，在Qiime2整合DADA2软件去除优化数据中存在的PCR扩增错误或测序错误，以获得样本中真实的序列信息的扩增序列变体（ASVs）列表，并基于Sliva16S r RNA数据库（v138），使用Qiime2中的Naïve bayes分类器对ASVs进行门和属水平的物种分类。口腔菌群多样性分析主要比较HIV感染组和非HIV感染组的Alpha多样性差异，包括丰富度指数（Ace），香农熵指数（Shannon）和辛普森多样性指数（Simpson）的比较，菌群多样性和菌群相对丰度比较均使用R-3.3.1软件stat包进行计算，并使用R语言ggplot2包进行作图。

1.3统计分析

计量资料采用M(P25,P75）描述，计数资料采用例数和百分比表示，使用SPSS 20.0软件进行统计分析，两组的一般资料比较采用非参数检验和χ2检验，两组口腔菌群多样性在门和属水平相对丰度比较采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义，均取双侧检验。

2、结果

2.1一般资料比较

本研究纳入30例HIV/AIDS患者和28例非HIV感染者，纳入分析的HIV/AIDS患者和非HIV感染者年龄、性别、饮酒史、吸烟史、合并龋齿和慢性牙周炎的构成比差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。HIV感染组21例（70.0%）患者已接受c ART，平均抗病毒治疗时间为3(0.8,4.5）年，c ART方案为：9例患者接受3TC+TDF/丙酚替诺福韦（/TAF)+EFV,6例患者接受3TC+TDF/TAF+LPV/r,5例患者接受3TC+TDF+多替拉韦钠（DTG),1例患者接受3TC+LPV/r+拉替拉韦钾（RAL）。21例已接受c ART的患者平均CD4细胞计数为396(176,570）个/μL，其中4例患者HIV-RNA高于PCR检测下限（国产试剂>100IU/m L，罗氏Cobas>20 copies/m L),4例患者HIV-RNA载量为3.0(2.2,3.7)log10IU/m L;9例未接受c ART平均CD4细胞计数为296(26,537）个/μL,HIV-RNA载量为5.3(5.0,5.7)log10IU/m L。

表1 HIV感染组和非HIV感染组一般资料比较[例数（占比/%）]

2.2二代测序信息比较

HIV感染组平均序列数为55 508(46 487,61 168)reads，非HIV感染组平均序列数为60 923(52 757,62 585)reads，两组测序数据量差异无统计学意义（Z=-1.494,P=0.135）。两组测序序列均以相似度100%去噪，共获得ASVs 5 543个，与Sliva 16S r RNA数据库比对进行物种注释在属水平共获取847个不同的属，其中HIV感染组740个，非HIV感染组554个。

2.3两组口腔菌群多样性比较

在门和属水平，HIV感染组口腔菌群的Alpha多样性（Ace,Shannon和Simpson指数）均显著高于非HIV感染组（P均<0.05），见表2。

表2 HIV感染组和非HIV感染组Alpha多样性指数比较（门和属水平）[M(P25,P75)]

2.4门水平口腔菌群差异比较

在门水平，相对丰度前5的菌群分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）和梭杆菌门（Fusobacteriota),HIV感染组和非HIV感染组差异的菌群如图1所示。对相对丰度前10的物种在门水平进行差异分析，其中拟杆菌门（Bacteroidota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）在HIV感染组的相对丰度显著高于非HIV感染组（P均<0.05），但厚壁菌门（Firmicutes）在HIV感染组的相对丰度显著低于非HIV感染组（P=0.015）。

2.5属水平口腔菌群差异比较

在属水平相对丰度前15的菌群中，链球菌属（Streptococcus）、罗斯菌（Rothia）和孪生球菌属（Gemella）在HIV感染组显著低于非HIV感染组（P均<0.05），但普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉菌属（Porphyromonas）、韦荣球菌属（Veillonella）和拟普雷沃菌属（Alloprevotella）在HIV感染组显著高于非HIV感染组（P均<0.05),HIV感染组和非HIV感染组在属水平差异的菌群如图2所示。

图1 HIV感染组和非HIV感染组门水平口腔菌群差异比较

图2 HIV感染组和非HIV感染组在属水平口腔菌群差异比较

3、讨论

本研究结果提示在门和属水平HIV/AIDS患者口腔菌群多样性均显著高于非HIV感染者。在门水平相对丰度前10的菌群中，拟杆菌门、弯曲杆菌门、蓝细菌门、酸杆菌门和绿弯菌门在HIV感染组的相对丰度显著高于非HIV感染组；在属水平普雷沃菌属、卟啉菌属、韦荣球菌属和拟普雷沃菌属在HIV感染组显著高于非HIV感染组。既往国外学者曾对HIV/AIDS患者多样性和菌群特征进行研究，但研究结果并不一致。JIMÉNEZ-HERNÁNDEZ等[4]认为，HIV/AIDS患者口腔菌群丰富度和多样性均显著高于非HIV感染者，其中链球菌属相对丰度下降，韦荣菌、棒状杆菌属、普雷沃菌等菌群相对丰度显著上升，与本研究的结果基本一致。但YANG等[5]对HIV感染合并肺部疾病的患者和非HIV感染者的唾液样本的研究提示HIV/AIDS患者口腔菌群丰富度和多样性显著低于非HIV感染者，与本研究不一致，可能与纳入患者的人群不同，以及HIV/AIDS患者的疾病状态差异有关。

既往研究表明，HIV感染相关口腔疾病（如慢性牙周炎）的风险显著高于非HIV感染者，且严重程度更高[8,9]，其具体病因未明，但口腔菌群失调可能与HIV感染相关口腔疾病发生及严重程度相关。国内外多项研究结果表明，普雷沃菌属和卟啉菌属等菌属与慢性牙周炎的发生显著相关[10,11,12]，本研究的结果也表明，上述菌属在HIV/AIDS患者中更常见，提示HIV/AIDS患者HIV感染相关口腔疾病（如慢性牙周炎）的风险显著高于非HIV感染者可能与口腔菌群失调相关，但有待进一步的研究证实。既往研究的结果表明使用益生菌对非HIV感染者的慢性牙周炎患者有良好的效果[13,14],HIV/AIDS患者能否通过益生菌治疗纠正口腔菌群失调，从而减少相关口腔疾病的发生，值得进一步的研究。

对于口腔菌群与口腔疾病相关性的研究，使用患者龈下菌斑样本优于唾液样本，但龈下菌斑的取材要求较高，临床常规诊疗中较难获取所有患者的龈下菌斑样本，因此本研究仅对非刺激性唾液样本进行研究，虽然患者的唾液与龈下菌斑的菌群有显著相关性[15]，但下一步研究应对HIV/AIDS患者龈下菌斑进行研究，进一步探讨其菌群特征。另外，口腔菌群的研究需纳入至少3个月内无服用抗生素的HIV/AIDS患者，免疫状态较差的HIV/AIDS患者常需使用抗生素治疗或预防感染，收集足够样本的难度稍大，因此本研究暂未对不同免疫状态的患者进行分组研究，下一步研究将纳入不同免疫状态的HIV/AIDS患者，进一步阐述其口腔菌群的特点。

综上所述，HIV/AIDS患者口腔菌群多样性高于非HIV感染者，且口腔菌群分布的特征也存在显著差异，提示HIV感染可能导致口腔菌群失调。由此推断HIV/AIDS患者相关口腔疾病（如慢性牙周病）的发病率高于非HIV感染者可能与口腔菌群失调有一定的相关性。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献:

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基金资助:佛山市卫生健康局医学科研课题(20230213,20240064);广州市科技局市校(院)联合资助项目(2024A03J0885)~~;

文章来源:梁淑珍,梁晓婷,邱玖香等.HIV/AIDS患者口腔菌群多样性和菌群分布特点分析[J].中国艾滋病性病,2024,30(03):259-263.