阿尔茨海默病是常见的老年性中枢神经系统变性疾病。目前全世界有4700多万人患有阿尔茨海默病，预计到2050年全球阿尔茨海默病患者将增加到1.31亿[1]，可见阿尔茨海默病已成为越来越严峻的威胁老年人健康的重大疾病。目前阿尔茨海默病发病的细胞分子机制尚未阐明，一旦启动阿尔茨海默病病程，其特征性的病理变化β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)在脑内特定区域聚集及过度磷酸化Tau蛋白形成的神经元纤维缠结，继发引起氧化应激反应和炎症反应，造成突触损伤、神经元变性死亡[2]，持续的神经损伤和神经丢失，导致缓慢的认知障碍和痴呆症。氧化应激反应及炎性反应参与阿尔茨海默病神经元变性凋亡，两者对神经元细胞的毒性作用很大[3]。核因子E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)存在于全身多个器官，是多种细胞抗氧化酶的重要调节剂[4]，在许多情况下通过Nrf2活化来诱导血红素加氧酶1(hemeoxygenase1,HO-1)表达发挥其细胞保护作用，研究证实Nrf2/HO-1信号轴通过抗炎、抗氧化、调控细胞凋亡等方式在治疗心血管系统疾病、癌症等方面发挥抵抗氧化应激损伤的作用[5,6,7,8]。

目前全球医学界对阿尔茨海默病仍束手无策，获批准的胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂以及非传统阿尔茨海默病治疗药物等可延缓患者的认知功能障碍[9,10]，但不能从根本影响疾病的进展。开发新的治疗方法已迫在眉睫，人们希望能阻断神经元变性死亡的通路，甚至动员内源性神经干细胞及时补充丢失的神经元[11]，达到真正意义上的治疗。近年来，研究证明干细胞移植技术可有效治疗神经退行性疾病，有望在神经损伤修复和功能重建中发挥作用[12,13]。骨髓基质中不仅有造血干细胞，还有能分化成多种骨髓间质成分的干细胞，被广义地定义为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有成神经元分化、内源性干细胞动员的作用和能力[14]。研究也证实，骨髓间充质干细胞治疗可发挥免疫调节作用，可有效缓解阿尔茨海默病模型鼠的病理表现，降低β淀粉样蛋白的神经毒性[15,16]。骨髓间充质干细胞的治疗很大程度上依赖于细胞的给予模式，众多研究提示鼻腔黏膜面积大、毛细血管丰富，细胞可以从鼻腔黏膜透过筛板沿着嗅觉神经通路进入脑和脑脊液从而避开血-脑屏障，进入脑内靶区，最大限度地减少移植细胞在外周器官的分布，是细胞递送至中枢神经系统的一个新的非侵入的细胞治疗方法[17]。

基于上述理论基础，该研究采用APP/PS1双转基因小鼠，经鼻腔给予骨髓间充质干细胞，观察骨髓间充质干细胞对APP/PS1双转基因小鼠认知功能的影响及机制，为阿尔茨海默病治疗的新途径提供理论依据。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，组间各指标比较采用单因素方差分析。

1.2 时间及地点

实验于2019年1月至2020年10月在山西大同大学脑科学研究所/中枢神经炎症变性疾病新药创制省市共建山西省重点实验室培育基地完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

选取双转染人APP695swe基因和人早老素1(PS1)dE9突变基因的8月龄阿尔茨海默病转基因(APP/PS1)雄性小鼠20只，同窝同性别野生型C57BL/6小鼠10只，体质量18-22g，购自南京大学模式动物研究所。动物实验均按照国际实验动物科学理事会的指导方针执行，经山西大同大学动物实验伦理委员会批准。实验动物饲养在山西大同大学脑科学研究所无菌洁净动物室，温度(25±2)℃，相对湿度40%，可自由进食普通饲料。

1.3.2 实验试剂

骨髓间充质干细胞由陕西师范大学西北濒危药材资源开发国家工程实验室提供；BCA蛋白定量试剂盒(中国碧云天生物技术公司)；兔抗小鼠APP抗体(批号：3823S,CST)；磷酸化Tau蛋白抗体(批号：20194,CST);Toll样受体2抗体(批号：ab108998,Abcam)；诱导型一氧化氮合酶抗体(批号：ADI-905-431-1,ENZOI)；核转录因子κB抗体(批号：3033S,CST);Nrf2抗体(批号：ab31163,Abcam);HO-1抗体(批号：ab13248,Abcam)；小鼠抗GAPDH抗体(批号：2118S,CST)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(批号：A0208，碧云天生物技术有限公司)；化学发光免疫印迹检测试剂盒(Bio-Rad公司)；胎牛血清、牛血清白蛋白、无血清培养添加剂B27、青霉素、链霉素和DMEM/F12细胞基础培养液(Gibco公司)。

1.3.3 实验仪器

莫里斯水迷宫(Morriswatermaze,MWM)软件SMART3.0及硬件(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；酶标仪(THERMO公司)；凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)；CO2培养箱(Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药方法

雄性8月龄APP/PS1双转基因小鼠20只随机分为骨髓间充质干细胞组和模型组(n=10)，同窝同性别野生型C57BL/6小鼠作为正常对照组(n=10)。给药时左手抓住小鼠耳后及背部皮肤让小鼠仰面，固定头部和尾部，右手持微量注射器，骨髓间充质干细胞组小鼠每个鼻孔滴入3μL透明质酸溶液(PBS溶解)，30min后滴鼻给予骨髓间充质干细胞悬液(1×106/次，参照早期实验的浓度和剂量[18,19])，单次滴入一侧鼻腔的药量为1μL，两侧鼻腔给药间隔1min，两侧鼻腔交替给药，每周两侧鼻腔总给药量共20μL，共给药治疗2个月，每周给药1次，共计给药8次。鼻腔给药后保持小鼠体位不变，使溶液充分吸入鼻腔上部，模型组小鼠和正常对照组小鼠鼻腔给予等量的生理盐水[20,21]。给药后观察各组小鼠呼吸运动情况，每周记录小鼠体质量。

1.4.2 Morris水迷宫检测

采用Morris水迷宫训练和测评小鼠空间学习和认知功能。水迷宫分为4个象限(NW、NE、SW、SE)，在SW象限放一个5.0cm×5.0cm的圆形平台，平台置于液面下2cm。水迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，置于一个安静、持续光照的地方，水温保持在23-25℃，小鼠最后一次给药后1周开始进行水迷宫测试。首先进行6d水迷宫训练，60s/次，如果在60s期间小鼠没有到达平台，则进行引导棒帮助小鼠到达平台，在小鼠到达平台后停留20s。训练结束后，同训练程序，进行6次认知功能测定，通过摄像头跟踪小鼠运动轨迹，SMART3.0软件系统记录运动时间和距离。

1.4.3 Westernblot法检测小鼠脑组织相关蛋白水平

行为学测试结束后1周，各组动物采用腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg)进行常规麻醉，开胸暴露心脏，使用0.1mol/LPBS左心室灌流，剪破右心耳，直至肝脏变白，取脑组织。在冰上用组织研磨器充分裂解整个全脑组织(按照10mg脑组织配比100μL裂解液)，高速离心提取蛋白，BCA法测定蛋白含量，调整各组蛋白质含量相同，加入上样缓冲液，100℃水浴中变性10min，通过10%SDS-PAGE分离各组蛋白提取物，转移至0.2μm聚偏二氟乙烯膜，加入一抗：兔抗小鼠APP(1∶500)、磷酸化Tau蛋白(1∶500)、Toll样受体2(1∶500)、诱导型一氧化氮合酶(1∶500)、核转录因子κB(1∶500)、Nrf2(1∶1000)、HO-1(1∶1000)、GAPDH(1∶1000),4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10000)，室温孵育2h;TBST洗膜，通过凝胶成像分析仪的ImageLab5.0软件操作曝光成像并测定吸光度值，以目的蛋白/GAPDH的吸光度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.5 主要观察指标

(1)水迷宫实验指标：小鼠逃避潜伏期时间，小鼠在平台所在象限活动度占总活动度的比例，小鼠运动轨迹地形图，小鼠在平台所在象限滞留时间占总时间的比例，小鼠在平台所在象限游的路径距离占总路径距离的比例；(2)小鼠脑组织中APP蛋白、磷酸化Tau蛋白的表达；(3)小鼠脑组织中炎性因子的表达；(4)小鼠脑组织中抗氧化因子的表达。

1.6 统计学分析

采用GraphPadPrism5.0统计软件进行处理。数据用表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 骨髓间充质干细胞改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能障碍

通过Morris水迷宫实验比较3组小鼠的学习记忆能力和空间认知能力。在定位航行实验中，3组小鼠在测试期间的逃避潜伏期各不相同，见图1A：正常对照组小鼠逃避潜伏期时间逐渐减少；与正常对照组相比，模型组小鼠在初期(第1天)较容易找到隐藏的平台，但是在后期(第4-6天)迅速忘记(P<0.01)，表明模型组小鼠记忆巩固受损，认知功能较正常对照组下降，阿尔茨海默病模型建立成功[22]。经过连续治疗2个月，与模型组相比，骨髓间充质干细胞组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.01)，结果提示骨髓间充质干细胞可改善阿尔茨海默病APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力。3组小鼠游泳速度相当，表明它们在水下平台定位的时间不同与运动能力无关，见图1B。在空间探索实验中，正常对照组小鼠的游泳路径高度集中在目标象限，模型组小鼠经常在每个象限随机游动，没有任何目的，而骨髓间充质干细胞组小鼠在水池较大的区域进行搜索，但仍倾向于集中在目标象限，见图1C。对于小鼠在平台所在象限滞留时间占总时间的比例以及小鼠在平台所在象限游的路径距离占总路径距离的比例，骨髓间充质干细胞组均高于模型组(P<0.05)，见图1D,E，结果表明骨髓间充质干细胞可有效改善APP/PS1转基因小鼠的空间记忆能力。

2.2 骨髓间充质干细胞调节APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白、磷酸化Tau蛋白的表达

模型组和骨髓间充质干细胞组小鼠脑内的APP蛋白水平均高于正常对照组小鼠，见图2。与模型组相比，骨髓间充质干细胞组小鼠脑内的APP蛋白水平明显增高(P<0.05)，促进APP蛋白向非淀粉样途径代谢，减少阿尔茨海默病的主要毒性物β淀粉样蛋白的生成。此外，与模型组相比，骨髓间充质干细胞组小鼠脑内磷酸化Tau蛋白水平明显低于模型组小鼠(P<0.05)，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞抑制APP/PS1转基因小鼠脑内神经炎症反应

如图3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠脑组织中Toll样受体2、诱导型一氧化氮合酶、核转录因子κB的表达水平显著增加，是正常对照组的1.3倍、2.7倍、1.4倍(均P<0.05)，然而经过骨髓间充质干细胞治疗后，小鼠脑内Toll样受体2的表达从模型组的0.58±0.02减少到骨髓间充质干细胞组的0.44±0.12(P<0.05)，减少了24%；诱导型一氧化氮合酶的表达从模型组的0.60±0.14减少到骨髓间充质干细胞组的0.39±0.04(P<0.05)，减少了35%；核转录因子κB的表达从模型组的1.31±0.07减少到骨髓间充质干细胞组的0.97±0.03(P<0.05)，减少了26%。以上结果表明骨髓间充质干细胞治疗可抑制APP/PS1小鼠脑内神经炎症反应。

2.4 骨髓间充质干细胞通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解APP/PS1转基因小鼠脑内氧化应激反应

如图4所示，与正常对照组相比，模型组小鼠脑组织中Nrf2和HO-1的表达水平显著下降，低于正常对照组1.7倍、1.6倍(P<0.05)，然而经过骨髓间充质干细胞治疗后，小鼠脑内Nrf2和HO-1的表达分别从模型组的0.56±0.23,0.49±0.03增加到骨髓间充质干细胞组的0.84±0.06,0.66±0.16(P<0.05)，分别增加了33%,25%。这些结果表明骨髓间充质干细胞上调了Nrf2和HO-1的表达，缓解APP/PS1转基因小鼠脑组织中的氧化应激反应。

2.5 生物相容性分析

见表1。

3、讨论

阿尔茨海默病是老年人痴呆的主要原因，发病率和死亡率都很高[23]，这种疾病的主要特征是出现记忆丧失和由于神经退行性改变引起的认知障碍。最近研究提出，干细胞移植可能具有治疗阿尔茨海默病的潜力[12,13,24]。该研究选择8月龄的APP/PS1转基因小鼠，经鼻腔给予骨髓间充质干细胞，观察通过鼻-脑途径迁移积聚脑内是否能改善小鼠的认知功能，并探讨其作用机制。水迷宫测试结果显示，阿尔茨海默病模型小鼠存在认知功能障碍，骨髓间充质干细胞组小鼠模型组到达平台所在位置的时间缩短，在平台象限活动的时间和距离比例均增加，证实经鼻腔给予骨髓间充质干细胞移植后这种认知障碍明显减轻，说明经鼻腔给予骨髓间充质干细胞可以改善这种认知障碍。为了探讨经鼻给予骨髓间充质干细胞对小鼠病理变化的影响，实验检测了阿尔茨海默病病理相关蛋白APP和磷酸化Tau的表达，发现经过鼻腔给予骨髓间充质干细胞治疗后降低了APP/PS1转基因小鼠脑内磷酸化Tau的表达，增加了APP蛋白的表达。神经纤维缠结是阿尔茨海默病最主要的病理特征之一，它主要是由Tau蛋白氧化磷酸化所形成的，Tau蛋白是一种微管组织相关蛋白，它与微管结合的能力会由于高度磷酸化而消失，氧化应激反应会促进Tau蛋白异常磷酸化，从而形成神经纤维缠结导致神经元功能丧失。APP是一种跨膜蛋白，在病理情况下APP通过β-分泌酶代谢途径，裂解APP产生有毒难溶的β淀粉样蛋白1-42，而β淀粉样蛋白1-42是阿尔茨海默病的主要毒性物质[25]。近年研究发现，β淀粉样蛋白的毒性作用与自由基有关，氧化应激参与了β淀粉样蛋白致神经毒性的调节[26]。通过对阿尔茨海默病患者尸检发现氧化损伤和磷酸化Tau蛋白形成的神经纤维缠结出现共定位，在接近磷酸化Tau的地方有一氧化氮阳性表达[25]，还有研究通过对阿尔茨海默病患者尸检发现有激活的星形胶质细胞、小胶质细胞及具有强烈毒性的免疫反应产物如肿瘤坏死因子α、补体C1、C3等因子的表达增加，这些因子相互作用引起炎症反应，炎症反应又会促进自由基生成与氧化应激反应[27,28]。

氧化应激是阿尔茨海默病发病的早期临床症状[29]，阿尔茨海默病患者脑中活性氧水平与正常人相比显著增加[30]。活性氧累积增加会导致氧化应激反应，从而破坏包括脂类、蛋白质和DNA在内的主要细胞成分，引起神经细胞功能障碍，导致神经元细胞凋亡。此外，活性氧还可通过激活核转录因子κB途径诱发神经炎症，进一步加重神经系统损伤，形成一个负性的级联放大反应[31,32]。氧化应激与炎症的致病机制密不可分，Nrf2/HO-1信号通路对机体氧化应激反应具有重要的调控作用，Nrf2在对抗阿尔茨海默病病理进程中具有减轻炎症反应的作用[33,34]。在生理情况下Nrf2和细胞骨架相关蛋白Keap1相结合形成二聚体，不具有进入细胞核内的能力；当内外环境发生改变如氧自由基生成增多时，则Nrf2与Keap1解离进入细胞核内结合抗氧化反应元件，调控氧化应激反应。在Nrf2调控的众多基因中，其下游因子HO-1因其较强的抗氧化功能而备受关注，HO-1激活可促进亚铁血红素代谢产生一氧化碳、亚铁离子及胆绿素3个产物，这3种产物均具有抗氧化功能，能够参与维持细胞氧化还原状态的平衡，发挥抗氧化作用，从而促进细胞的存活。近期一项在敲除Nrf2的APP/PS1转基因小鼠的体内研究发现，Nrf2缺乏后β淀粉样蛋白增加的同时伴随着炎症反应明显增强[35]。

由此可见，Nrf2/HO-1信号通路是早期干预阿尔茨海默病的重要靶点。该研究检测结果表明经鼻腔给予骨髓间充质干细胞降低了APP/PS1转基因小鼠脑内炎性因子Toll样受体2、诱导型一氧化氮合酶、核转录因子κB的表达，促进了抗氧化因子Nrf2和HO-1的表达。这些数据表明经鼻腔给予骨髓间充质干细胞治疗能降低APP/PS1转基因小鼠脑内炎症反应和氧化应激反应，这与以前的报道一致[36,37]。

综上所述，实验发现经鼻腔给予骨髓间充质干细胞治疗可以改善APP/PS1转基因小鼠的认知功能，减少磷酸化Tau的生成，增加β淀粉样蛋白的前体蛋白APP的表达，减少β淀粉样蛋白的神经毒性作用，其机制可能是通过Nrf2/HO-1信号通路降低小鼠脑内炎性因子的表达，促进抗氧化因子的生成，从而建立稳定的认知功能。但骨髓间充质干细胞治疗阿尔茨海默病的具体作用机制仍有待于进一步的探索和验证，在今后的研究中要以Nrf2为靶点来设计进行深入探究。

参考文献:

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[11]尉杰忠,闫玉清,谷青芳,等.法舒地尔通过促进APPIPS1双转基因小鼠神经再生改善认知功能[J].中国病理生理杂志,2018,34(7).1153-1161.

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[2S]谷青芳,尉杰忠,郭敏芳,等.新型Rho激酶抑制剂FSD-C10对阿尔茨海默病模型小鼠的神经保护作用[J].中国病理生理杂志,2019,35(12):2227-2234.

文章来源：谷青芳,郭敏芳,刘晓琴,穆秉桃,李伟梅,宋丽娟,柴智,马存根,尉杰忠.骨髓间充质干细胞改善APP/PS1模型小鼠认知功能的机制[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3108-3113.