变应性鼻炎（allergicrhinitis,AR）是耳鼻咽喉科常见的鼻黏膜过敏性炎症疾病，其全球平均发病率高，可影响到约40%的一般人群[1]，以鼻痒、鼻塞、清涕及喷嚏为典型症状，严重影响患者健康与生活质量，一直是临床上研究与治疗的难点与热点。关于AR发病机制的研究已开展多年，目前发现变应原诱导出现的天然免疫系统和适应性免疫系统的局部表达失衡在AR发病中扮演重要角色[2]。近年来的多项研究表明，适应性免疫系统中的辅助性T细胞17(Thelp17cells,Th17）的异常活化在AR发病，尤其是中国人AR发病中发挥关键作用[3,4]。

白介素-38(interleukin-38,IL-38）是IL-1家族的重要成员之一，它主要由上皮细胞和浸润的外周血单个核细胞分泌，通过自分泌与旁分泌方式发挥作用[5]。研究发现IL-38在多种免疫相关的炎症性疾病比如克罗恩病、系统性红斑狼疮以及支气管哮喘等的发病中起重要作用，机制主要与IL-38对Th17细胞及其相关因子表现出的抑制作用有关[5,6,7]。作为与支气管哮喘相似的上气道变应性疾病，IL-38在AR的发病中是否存在同样的作用与机制，目前国内外文献还尚未见有报道。因此，本研究拟通过对AR患者局部及全身中IL-38、Th17细胞及其相关因子的表达及相关性研究，初步探讨IL-38是否与AR的发病相关，它对Th17细胞的拮抗在AR中的减弱是否是AR发病的机制之一。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2018年5月到2019年5月因鼻中隔偏曲于我院住院手术的患者为研究对象，所有患者术前均行电子鼻咽镜检查及鼻窦CT检查。鼻中隔偏曲伴AR患者为AR组，所有AR患者均依据变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015，天津）标准纳入；单纯鼻中隔无AR患者为对照组。各组受试者的一般资料见表1,2组受试者在性别、年龄方面的差异无统计学意义（P>0.05）：研究对象排除标准为[8]:1月之内患过急性鼻炎、鼻窦炎急性病者；鼻部慢性病者（如慢性鼻-鼻窦炎等）；有哮喘病史者，3周之内使用抗生素、抗组胺药、白三烯阻断剂、鼻腔减充血剂及鼻用糖皮质激素，最近半年内接受过免疫抑制剂等治疗的患者。所有入选患者均已签署知情同意书，本研究获得重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

表1各组受试者的一般资料

1.2实验试剂

反转录OligodT引物购自天根生化，OligodT(15）、dNTPMix以及荧光定量PCR试剂盒SYBR®PremixExTaqTMⅡ（TliRNaseHPlus)(RR820Q）均来自Takara公司，反转录试剂盒购自ThermoFisher公司；鼠抗人IL-38(eBioscience），羊抗鼠IgGIL-38多克隆抗体（Sigma-Aldrich),SP免疫组织化学检测试剂盒（PV-9000，中杉金桥）；流式荧光标记抗体（CD4-Percpcy抗体、IL-17-PE抗体）、固定/破膜液、人IL-38、IL-17及IL-6ELISA试剂盒均购自eBioscience公司，重组人IL-38购自Absin公司。

1.3样本处理

取所有研究对象在鼻内镜下鼻中隔偏曲矫正手术中切除的部分下鼻甲组织，标本分为两部分：一部分置于液氮中保存，以备PCR检测；另一部分常规制成石蜡块保存。抽取AR组及对照组晨起空腹静脉血标本10ml，其中3ml离心后收集血清，置-20℃保存备ELISA检测；剩余标本4℃放置保存，6h内行流式细胞术检测及干预实验。

1.4实时荧光PCR检测局部组织中IL-38mRNA的表达

将保存的标本组织予以研磨后用细胞裂解液裂解，采用Trizol法提取组织中总RNA。以紫外分光光度仪检测纯度合格后，以反转录试剂盒反转录成cDNA。以cDNA为模板采用PCR试剂盒在ABIprism快速7500型荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）上进行定量PCR检测，IL-38引物序列为：上游引物5'-AAGAAGGACCTCCGGCTCT-3'，下游引物5'-TGACTCAGAATCTGGCGTATTTC-3';GAPDH引物序列为：上游引物5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游引物5'-GCCCAATACGACCAAATCAC-3'。实时荧光PCR反应条件：95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃34s,40个循环，每个标品设置3个平行反应复孔，以相对Ct值法分析目的基因相对的表达差异，计算方法参考相关文献[9]。

1.5免疫组化检测检测局部组织中IL-38的表达

对石蜡切片予以常规脱蜡、梯度酒精脱水，3%H2O2去除内源性过氧化物酶，再以10%的正常羊血清封闭，按照SP试剂盒说明书步骤进行进一步实验操作，DAB染色，苏木精复染、脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后予以镜检。一抗及二抗工作液浓度采取1∶100，以磷酸缓冲溶液为阴性对照一抗。结果判定：于显微镜一侧目镜安装细胞计数网格，于20倍镜下选取阳性细胞最多的5个高倍视野（HPF，×400），然后取其均值予以记录。

1.6流式细胞术检测外周血中Th17细胞比率

(1)将测样管与同型对照管分别标记；(2)在培养管中依次加入RPMI1640培养基、PMA、离子霉素、研究对象的外周血标本250µl，充分混匀后孵育5h，最后分别在各管中加入完成孵育的全血200µl;(3)将0.1%TritonX-100分别加入各上样管，作用15min，从而完成对各细胞的破膜打孔；(4)于各流式管中加入5µlCD4-APC，然后依次加入20µlPE-抗IL-17及同型PE-IgG110µl，室温下避光30min;(5)结果判断：将400µl的PBS加入各管，低速涡旋混匀后调节电压，调节补偿同型对照管，对待测样品检测完成后采用CellQuest软件对数据予以分析。

1.7ELISA检测外周血中IL-38及Th17相关因子IL-17、IL-6的表达

将待测收集的各组血清标本于室温下放置20min，按照试剂盒说明书于各反应孔中依次加入50µl稀释后的标准品、血清标本、生物素标记的抗体，盖上膜板后振荡，混匀，37℃温育60min后以洗涤液人工洗涤4次，加入亲和链霉素-HRP80µl后振荡混匀后37℃温育30min，洗涤液人工洗涤4次后加入50µl的底物A、B,37℃避光温育10min，酶标仪中加入50µl终止液后于酶标仪450nm处读取吸光度（OD）值，绘制标准曲线并计算2组标本中IL-38、IL-17、IL-6的质量浓度。

1.8重组IL-38干预AR组外周血单个核细胞后Th17表达

将收集的研究对象静脉血4ml以密度梯度离心法得到PBMC,PBS洗涤2次，取PBMC计数为1×106个，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640液。设置研究分组如下：(1)对照组不加入重组人IL-38，加入PBS液培养；(2)低浓度干预组刺激培养Th17环境中加入低浓度重组人IL-38(100ng/L);(3)高浓度干预组刺激培养Th17环境中加入高浓度重组人IL-38(500ng/L)[10]。以200µl/孔加入48孔无菌细胞培养板内培养6h，每组设16个复孔，各组中均分别加入终质量浓度为1µg/ml抗CD3和抗CD28单克隆抗体，以及终质量浓度为20ng/ml的IL-1β、IL-6及TGF-β刺激细胞后置于5%CO2、37℃培养箱中培养48h。采取同1.6所示方法并加入抗体孵育后，流式细胞仪检测各组中Th17细胞的频数水平。

1.9统计学分析

采用SPSS25.0医学统计软件进行数据分析，以均数±标准差表示计量资料。采用t检验行2组间均数比较，多组间比较采取单因素方差分析，以Spearman相关性检验分析两连续性变量之间的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1局部组织中IL-38的表达

实时荧光定量PCR结果显示，2组的局部鼻腔黏膜组织中均可以检测出IL-38mRNA,AR组局部组织中IL-38mRNA的表达水平为2.82±0.86，对照组局部组织中IL-38mRNA的表达水平为6±1.95。与对照组相比，AR组患者局部组织中IL-38mRNA水平明显降低（P<0.05，图1）。免疫组化的结果显示，IL-38阳性表达呈棕黄色或棕褐色染色，主要表达于鼻黏膜下层及间质中。与对照组相比（16.49±5.93/HPF),AR组局部阳性表达水平显著降低（5.59±1.87/HPF），差异具有统计学意义（P<0.05，图2）。

图1变应性鼻炎患者与对照组局部组织中IL-38mRNA的表达水平

图2变应性鼻炎患者与对照组局部组织中IL-38蛋白的表达水平（×200)

2.22组标本外周血中Th17细胞的百分比率

流式细胞检测结果显示，AR组标本的外周血中Th17细胞百分比率为5.62%±0.87%，对照组的外周血中Th17细胞百分比率为1.75%±0.51%。与对照组相比，AR组患者外周血中Th17细胞百分比率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，图3）。

2.32组标本外周血中IL-38及Th17相关因子IL-17、IL-6的表达

ELISA检测结果显示，AR组标本的外周血中IL-38表达水平为（119.95±11.22)pg/ml，较对照组[（281.71±16.42)pg/ml]的水平均明显减少，2组间差异具有统计学意义（P<0.05，图4);AR组的IL-17及IL-6表达水平分别为（137±16.21)pg/ml和（164.78±19.86)pg/ml，均明显高于对照组的相关因子水平[（70.55±16.20)pg/ml与（76.06±15.56)pg/ml],2组间差异具有统计学意义（P<0.05，图4）。

图3变应性鼻炎患者与对照组外周血中Th17细胞频数

图4变应性鼻炎患者与对照组外周血中IL-38,IL-17,IL-6的表达水平

2.4AR组局部组织及外周血中IL-38表达与Th17细胞及相关因子的相关性分析

Spearman相关性检验结果显示，AR组局部组织中IL-38mRNA与蛋白表达水平与外周血中Th17细胞百分比率呈负相关；与Th17细胞相关因子IL-17、IL-6的表达均呈负相关；AR组外周血中IL-38的表达与外周血中Th17细胞百分比率呈负相关，与Th17细胞相关因子IL-17、IL-6的表达均呈负相关（图5,P<0.01）。

2.5重组IL-38干预后AR组PBMC后Th17细胞频数水平的变化

检测干预AR组的PBMC前后Th17细胞百分比率水平发现：与对照组（5.02%±0.91%）相比较，高浓度干预组（2.51%±1.31%）及低浓度干预组（2.66%±1.81%)Th17细胞百分比率显著降低（P<0.05，图6）；高浓度干预组的Th17百分比率较低浓度干预组有所降低，但差异未见统计学差异（P=0.693，图6）。

图5变应性鼻炎患者IL-38的表达水平与Th17相关指标的相关性分析

图6不同浓度（高、低浓度）重组IL-38及PBS干预后变应性鼻炎患者外周血中单个核细胞后各组中Th17细胞表达水平的变化

3、讨论

变应性鼻炎（AR）的发病是一个由多因素参与其中的复杂过程，涉及环境、遗传及免疫等多个方面。目前研究已经证实Th细胞及其分泌的细胞因子的失衡状态在AR的发生发展中起着关键作用，尤其是新近发现的Th17细胞，其异常活化成为AR发病的关键推手[11,12]。我们的研究也发现在AR组患者外周血中存在着Th17细胞的高表达，与既往研究结果一致，说明与正常健康人相比，AR患者体内的Th17细胞存在失衡，其免疫环境中缺少对Th17细胞的抑制因素；因此，针对正常人体内存在着的与Th17细胞相关的制衡因素方面的研究成为阐明AR疾病机制的关键。

IL-38最早于2001年报道，当时命名为IL-1HY，编码基因位于人类染色体2q13-14.1，临近编码IL-1Ra(IL-1RN）和IL-36Ra(IL-36RN）的基因[13,14]。研究证实[15]IL-38主要与IL-36受体相结合，在炎症反应过程中发挥抑制性作用：在银屑病、克罗恩病及系统性红斑狼疮等免疫炎症性疾病中均发现IL-38的表达降低，且降低水平与疾病的严重程度相关[16,17,18]。国内有学者通过对哮喘患者肺功能指标及痰中IL-17、IL-38水平的检测发现：哮喘患者痰中IL-17水平升高，IL-38水平降低，IL-17、IL-38可能参与哮喘的发病，且在一定程度上反映哮喘的严重程度；在支气管哮喘患者血清中类固醇激素治疗组IL-38表达水平较正常组升高，且IL-38与调节性T淋巴细胞呈正相关[19,20]，说明IL-38在气道炎症性疾病的发病中可能发挥作用。在AR中，我们发现AR患者局部鼻黏膜及全身外周血中均存在IL-38表达水平的降低，使其抗炎作用减弱，从而打破了IL-38抗炎作用与Th17细胞促炎作用之间的平衡，引发了后续的炎症反应，导致了AR的发生，在AR发病中存在着与其促进哮喘发病类似的作用与机制。

近年来针对IL-38抗炎作用的研究也不断深入：IL-38作为重要的抗炎因子，在炎症情况下抑制人PBMC分泌IL-17[21]，还可以降低LPS所诱导的IL-6、IL-8产生或抑制THP-1细胞表达IL-17；过表达IL-38的人巨噬细胞则能抑制CD3+CD4+T细胞分泌IL-17[22,23]。由于IL-17是Th17主要效应因子，而IL-6又是Th17分化所必需的重要因子[24]，所以IL-38对IL-6与IL-17的抑制作用可能就是其影响Th17抗炎作用的关键。我们的研究发现在AR患者的局部及外周血中的IL-38的表达不仅与外周血中的Th17细胞百分比率呈负相关，还与外周血中Th17的相关因子IL-17、IL-6呈负相关，证明在正常体内环境中，IL-38对Th17细胞的分化（Th17比率）及效应阶段（Th17相关细胞因子的表达）均发挥到了抑制作用，它对IL-17、IL-6等因子的负性作用正是其发挥抗炎作用的关键。

为了验证IL-38在AR中的抗炎机制，我们进行了干预实验，结果发现在AR中，重组IL-38的过表达明显地抑制了AR患者外周Th17细胞的表达，而这一抑制作用，可能存在于Th17的分化阶段或效应阶段，其具体机制目前尚不清楚。作为IL-36R的特异性受体，IL-38被发现可与IL-36R结合并诱导其抑制作用，导致TLR结构无法完成MyD88的募集从而抑制NF-κB及MAPK等炎症通路，其中NF-κB通路抑制又会影响到雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）激活；而mTOR是一种细胞能量感应分子，活化的mTOR可通过磷酸化作用激活调节Th17细胞分化的重要环节—STAT3，推测其正是IL-38调控Th17轴的关键因素[25,26]。IL-38在AR中对Th17轴调节的具体机制是否与此相同尚待进一步研究。

有趣的是，干预实验发现经过不同浓度的重组IL-38的干预，虽然都引起了AR组Th17细胞的下降，但是在高浓度与低浓度的重组IL-38干预组之间Th17的下降并未显示出显著的差异，即未出现常见的剂量依赖效应，这一点可能与不同浓度的IL-38表现出不同的调控作用相关，因为既往研究发现IL-38对炎症介质体外表达没有剂量依赖效应，它不是典型的受体拮抗剂：低浓度IL-38与IL-36Ra可募集抑制性共受体，但在高浓度下，IL-38却募集刺激性共受体，不发挥拮抗作用[27,28]。我们实验中所设置的2个浓度，有可能高浓度组的浓度已经接近其非抗炎作用的浓度，从而出现了上述结果，这提示我们在未来利用IL-38治疗炎症的时候要充分考虑到其作用的浓度，只有合适的浓度范围才可能更好地发挥其抗炎作用。

综上所述，IL-38是体内免疫环境中抗炎的关键因素之一，深入研究IL-38具体的抑炎作用与AR的关系对于认识疾病发生的机制有重要价值。由于本研究样本量较少，干预分组较为简单，且主要干预了外周环境，未对鼻腔局部环境进行干预实验，具有一定的局限性。另外，IL-38与Th17在鼻腔局部的关系及其分子信号层面的具体机制尚需进一步的研究予以证实。

参考文献：

[1]熊培政,章刚,彭顺林,等.树突状细胞在变应性鼻炎免疫应答中的作用[J].免疫学杂志,2019,35(2):174-178.

[2]王帅,徐子琴陈冬,等.过敏性鼻炎患者外周血Tfhs中ICO8的表达及ICOS阻断剂对TfhsLl-21表达的影响[J].免疫学杂志,2019,35(7):619-623.

[8]丁爽王洪江尹悦等.肥大细胞活化分子及其抗体在变应性鼻炎及鼻息肉中的表达及机制探讨[.J临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2019,33(10)975-982.

文章来源：王晓强,柯霞,沈暘,康厚墉,洪苏玲.白介素38在变应性鼻炎发病机制中作用的初步研究[J].免疫学杂志,2021,37(07):604-611.