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IL-17A对人子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖的影响

2021-07-05 105 上传者：管理员

摘要：目的：探讨IL-17A对人子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖的影响。方法：免疫细胞化学方法检测IL-17A受体在正常和子宫内膜异位症在位内膜上皮细胞及基质细胞中的表达;MTT法观察不同浓度IL-17A对正常和子宫内膜异位症在位上皮和基质细胞增殖的影响。结果正常和子宫内膜异位症在位上皮细胞和基质细胞均表达IL-17A;但IL-17A对正常子宫内膜细胞增殖无影响;250μg/mlIL-17A对子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖影响显著（P<0.05）。结论：250μg/mlIL-17A能显著促进子宫内膜异位症在位内膜细胞的增殖,为进一步证实IL-17A可能在子宫内膜异位症的发生作用提供实验基础。

关键词：
在位内膜
子宫内膜异位症
炎症性疾病
细胞增殖
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子宫内膜异位症（endometriosis,EMS）是一种复杂的炎症性疾病，全球女性的患病率可达10%[1]。但其确切发病机制尚未明确，子宫内膜种植学说、淋巴及静脉播散学说、遗传因素等学说都无法完全解释。近年来，许多研究者试图阐明免疫系统在子宫内膜异位症中的作用，并且已经报道了几种免疫的现象，提示免疫反应很可能促进EMS的发生、发展。白介素-17A(interleukin-17A,IL-17A）是一种细胞因子，由Th17细胞分泌产生，主要生物学效应是促炎反应。目前已发现IL-17在感染、移植免疫及自身免疫性疾病中发挥重要作用[2]。Harada等研究发现在EMS患者中，IL-17可诱导腹腔中T细胞、巨噬细胞分泌IL-1b、TNF-α、IL-6分泌，增强促炎反应，间接参与EMS的发病过程[3]。Khaleque等近期研究发现EMS患者血清中IL-17A和IL-6浓度均明显升高，并且不孕组IL-17A显著高于非不孕组及对照组，提示IL-17A和IL-6可能在EMS的发生、发展中发挥重要作用[4,5]。但IL-17A在EMS在位内膜细胞中的表达如何及是否影响其增殖研究很少。

本研究以人正常子宫内膜细胞和EMS在位子宫内膜细胞作为研究对象，通过观察IL-17A在正常及EMS在位细胞的表达及对正常及异位子宫内膜细胞增殖的影响，旨在探讨IL-17A与子宫内膜异位症发生发展的关系。

1、材料与方法

1.1病例与标本

选取2017年2月至2017年10月在河北医科大学第二医院因不孕不育就诊的患者作为研究对象。37例正常的子宫内膜组织取自于2次胚胎移植术后，不明原因移植失败，且行刮宫术，诊断子宫内膜组织形态无病理改变的患者（病理结果1天出报告，若子宫内膜组织正常则纳入实验，异常者剔除）。26例子宫内膜异位症在位子宫内膜组织取自患有巧克力囊肿需要刮宫的患者。患者年龄为22～40岁，月经周期规律25d～35d，所有患者术前3个月均未使用过激素类药物。将无菌条件下刮取的子宫内膜组织浸于冰浴的10%胎牛血清养基中，进行分离培养。刮取子宫内膜组织得到河北医科大学第二医院伦理委员会的许可，征得患者同意并签署知情同意书。

1.2免疫组织化学

4%多聚甲醛固定细胞爬片。4℃孵育1:50兔抗人IL-17A受体的抗体（北京博奥森）过夜；37℃孵育1∶100羊抗兔IgG（北京中杉）30min,1∶100链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（北京中杉）37℃孵育30min,DAB（北京中杉）室温下显色5～30min，镜下控制显色时间，苏木素复染2min，脱水，透明，中性树胶封片后显微镜观察。阴性对照采用PBS代替一抗。

1.3MTT增殖实验

按IL-17A（北京义翘神州）药物质量浓度分为5组，0、50、100、250、500、700µg/ml，每组设5个复孔。选取IL-17A最佳质量浓度250µg/ml处理子宫内膜细胞作为实验组，0µg/mlIL-17A作为对照组。37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养24h后，每孔加入20µl(5mg/ml)MTT溶液，放入培养箱中继续避光培养4h，酶标仪490nm波长，测定光密度OD490nm值。

1.4统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计学分析，2组数据之间比较采用两独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1免疫细胞化学染色观察正常及EMS患者子宫在位内膜细胞IL-17A受体表达

2.1.1正常子宫内膜上皮细胞（EECs）及基质细胞（ESCs)IL-17A受体的检测

免疫细胞化学方法显示正常子宫内膜上皮细胞（EECs）胞质呈棕黄色，为阳性；少数细胞核呈阳性（图1a）；同法显示正常子宫内膜基质细胞（ESCs）胞质呈棕黄色，为阳性；细胞核不着色，为阴性（图1b）。以上提示正常子宫内膜上皮细胞和基质细胞IL-17A受体表达均阳性，上皮细胞的细胞质及胞核均有表达，以细胞质表达为主；基质细胞仅在细胞质表达。

图1正常子宫内膜细胞的IL-17A受体的观察

2.1.2子宫内膜异位症患者子宫内膜上皮细胞及基质细胞IL-17A受体的检测

免疫细胞化学染色显示子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜上皮细胞（EECs）胞质呈棕黄色，为阳性；少数细胞核呈阳性（图2a）；同法检测显示子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜基质细胞（ESCs）胞质呈棕黄色，为阳性；细胞核不着色，为阴性（图2b）。以上结果提示EMS患者在位子宫内膜上皮细胞和基质细胞，IL-17A受体表达均阳性。上皮细胞的细胞质及胞核均有表达，以细胞质表达为主；基质细胞仅在细胞质表达。

图2子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞的IL-17A受体的观察

2.2MTT法检测IL-17A对正常及子宫内膜异位症患者子宫在位内膜细胞增殖的影响

2.2.1IL-17A对正常子宫在位内膜上皮细胞增殖的影响

经终质量浓度分别为0（对照组）、50、100、250、500、700µg/mlIL-17A的DMEM/F-12培养液处理细胞后，MTT检测对照组与各实验组的细胞活力（A490nm值）分别为：0.142±0.004、0.139±0.003、0.141±0.006、0.140±0.004、0.139±0.003、0.143±0.005，各实验组与对照组的差异均无统计学意义（P=0.462，表1）。

表1不同浓度IL-17A作用于正常子宫内膜上皮细胞吸光度值

2.2.2IL-17A对正常子宫在位内膜基质细胞增殖的影响

经终质量浓度分别为0（对照组）、50、100、250、500、700µg/mlIL-17A处理细胞后，MTT检测对照组与各实验组的细胞活力（A490nm值）分别为：0.148±0.008、0.145±0.009、0.148±0.014、0.149±0.007、0.146±0.005、0.142±0.010，各实验组与对照组的差异均无统计学意义（P=0.462，表2）。

表2不同浓度IL-17A作用于正常子宫内膜基质细胞吸光度值

2.2.3IL-17A对子宫内膜异位症患者子宫在位内膜上皮细胞增殖的影响

经终质量浓度分别为0（对照组）、50、100、250、500、700µg/mlIL-17A处理细胞后，MTT检测对照组与各实验组的细胞活力（A490nm值）分别为：0.164±0.005、0.167±0.007、0.177±0.010、0.181±0.005、0.180±0.005、0.176±0.004，各实验组OD490nm值与0µg/ml组OD490nm值分别比较，除50µg/ml组与0µg/ml组差异无统计学意义外，其余各实验组OD490nm值较对照组均升高，差值具有统计学意义（P=0.004）（表3），且实验组100、250、500、700µg/ml之间比较，其差值无统计学意义。

表3不同浓度IL-17A作用于子宫内膜异位症患者在位上皮细胞吸光度值

2.2.4IL-17A对子宫内膜异位症患者子宫在位内膜基质细胞增殖的影响

经终质量浓度分别为0（对照组）、50、100、250、500、700µg/mlIL-17A处理细胞后，MTT检测对照组与各实验组的细胞活力（A490nm值）分别为：0.177±0.009、0.178±0.010、0.190±0.004、0.197±0.009、0.194±0.003、0.189±0.004，各实验组OD490nm值与0µg/ml组OD490nm值分别比较，除50µg/ml组与0µg/ml组差异无统计学意义外，其余各实验组OD490nm值较对照组均升高，差值具有统计学意义（P=0.004）（表4），且实验组100、250、500、700µg/ml之间比较，其差值无统计学意义。

表4不同浓度IL-17A作用于子宫内膜异位症患者在位基质细胞吸光度值

3、讨论

EMS的形成、发展过程有众多的免疫因素参与，如各种免疫细胞、细胞因子、趋化因子等，其相互作用共同促进了异位内膜的植入以及异位内膜组织的浸润的发生和发展。研究发现[6]，子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜与正常人子宫内膜细胞的生物学特性并不相同。该研究认为异位症患者的在位子宫内膜细胞拥有更强的迁移、侵袭、种植、增殖及血管形成能力。也有研究表明内异症患者在位内膜annexinI的表达要低于正常人子宫内膜，而低浓度的annexinI可引起PEG2和雌二醇的表达增加，间接促进细胞增殖、迁移、黏附以及血管形成，进而促进内异症病灶的形成与发展[7]。

Hirata报道，IL-17显著增加EMS间质细胞IL-8的分泌，TNF-α可增强IL-17诱导的间质细胞IL-8的分泌，IL-8具有刺激间质细胞增生的作用，IL-17还可促进COX-2的表达和间质细胞的增生[8]。研究发现[9],EMS在位及异位子宫内膜组织和腹腔液中IL-17A含量均显著增加。本实验从形态学观察显示：IL-17A在人正常与EMS患者在位子宫内膜上皮和基质细胞中均有表达；不论在正常的子宫在位内膜细胞还是EMS患者子宫在位内膜细胞，其上皮细胞的细胞质及胞核均有表达，以细胞质表达为主；而基质细胞仅在细胞质表达，且表达没有明显差异，提示IL-17A可能需要某种因子刺激或特定条件下才发挥其效应。但本实验只在形态学方面对内异症患者在位子宫内膜细胞与正常人子宫内膜细胞进行了比较，还需要从蛋白或基因表达层面着手，研究二者甚至是与异位病灶处子宫内膜细胞的生物学特性。

现今的研究证明,子宫内膜碎片(腺上皮及间质细胞)必须通过黏附、侵袭和血管形成方可以生存、生长,并引起病变和症状。这一过程的完成是以不同的在位内膜的不同生物学特性,甚至基因差异为基础的[10]。本研究MTT实验同样显示，在EMS患者在位内膜细胞中，除含IL-17A50µg/ml组与0µg/ml组未引起子宫在位内膜细胞增殖外，其余各浓度IL-17A均可刺激EMS在位内膜细胞的增殖，以250µg/ml最为显著。但对正常子宫内膜细胞的增殖无显著影响。由此推测虽然正常子宫内膜也表达IL-17A受体，但可能因进一步激活的信号通路或下游效应分子不同，形成不同的微环境，由此决定了是否有利于子宫内膜的种植。

总之，IL-17A作为新发现的炎症因子，可能通过子宫在位内膜细胞增殖参与了异位症的发生发展，但其生物学特性及其与子宫内膜异位症的关系并没有被完全阐明，仍需要通过对其作用信号通路和靶点的进一步研究，明确其在子宫内膜异位症中的作用。

参考文献：

[7]刘海元,郑艳华.张建中,等.子宫内膜异位症患者血浆蛋白质指纹图谱诊断分类树模型的初步建立[J.中华妇产科学杂志,2009,.44(8):601-604.

[9]杨璐,马思琪,孙文秀;等.IL-17AIL-17RA在子宫内膜异位症中的作用[J].世界最新医学信息文摘,2015,15(30):96.

[10]郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程[J].中华妇产科杂志,2005,40(1):3-4.

文章来源：郭燕红,杨利华,张丽,乜照燕,马毓梅,陈炜,张雷.IL-17A对人子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖的影响[J].免疫学杂志,2021,37(07):624-628.