三黄四物汤（Sanhuang-Siwu-Tang,SST）出自于医宗金鉴，由当归、川芎、白芍、地黄、黄芩、黄连和大黄7种药材组成，主要治疗热盛、经前吐衄等妇科疾病[1]。为扩展其临床适用范围，故对其抗炎作用进行研究。我们前期研究表明，三黄四物汤水提取物具有较好体外抗炎活性。本研究基于体外抗炎活性实验及HPLC谱图分析，对比三黄四物汤水提取物和乙醇提取物的差异，以获得现实应用中具有较好抗炎活性提取物的提取煎制方法。

1、材料及方法

1.1药材及试剂

药材当归、川芎、白芍、熟地黄、黄芩、黄连、大黄（购自韩国，圆光大学JangKyukwan教授鉴定）；RAW264.7细胞（韩国圆光大学药学院）；ELISA试剂盒（R&Dsystems,USA);Nuclearextraction试剂盒（CaymanChemical,USA);iNOS、COX-2、MAPK(P-ERK、P-p38、P-JNK、ERK、P-38、JNK）、NF-κB(p65、p-IκB-α、IκB-α）抗体（CellsignalingTecnology,USA）；二抗（SantaCruzBiotechnology,Germany）。HPLC用水和乙腈均为色谱纯（J.T.Baker,USA），其他试剂为分析纯（Tokyo,Japan）。

1.2提取物的制备

取干燥药材，分别制备三黄四物汤（当归10g、川芎10g、白芍15g、熟地黄10g、黄芩10g、黄连10g、大黄10g）和各药材单品（各取5g),500ml蒸馏水或无水乙醇回流提取2.5h，共2次，合并提取液并浓缩，得总浸膏。三黄四物汤水提取物（SSTW）和乙醇提取物（SSTE）回收率分别为38.85%、33.64%。

1.3HPLC图谱分析

1.3.1仪器及软件

YL9100HPLC系统（YoungInChromassCo.,Korea):YL9101真空脱气机，YL9110高压输液泵，YL9160PDA检测器。分析软件：YL-Clarity(YoungLinInstrimentsCo.Inc.,Version4.0.3.876）。

1.3.2色谱条件

色谱柱：PhenomenexGeminiNX-C18(250'4.6mm,5µm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序（B%):0min(5%)-20min(25%)-30min(25%)-45min(45%)-50min(100%)-60min(100%）；样品质量浓度：10mg/ml；进样量：10µl；流速：0.7ml/min；检测波长：280nm。

1.3.3精密度试验

SSTW和SSTE分别在“1.3.2”项色谱条件下连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该仪器精密性良好。

1.3.4稳定性试验

SSTW和SSTE分别在“1.3.2”项色谱条件下分别于0、2、4、6、8、12、24、32、48h进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在48h内均稳定性良好。

1.3.5重复性试验

平行制备5份SSTW，分别在“1.3.2”项色谱条件下测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

1.4细胞培养及存活率检测（MTT法）

RAW264.7细胞于含有10%胎牛血清的RMPI培养液、37℃、5%CO2条件下培养。RAW264.7细胞种植于96孔板，细胞贴壁后，加入SSTW或SSTE，对照组加入等体积RMPI培养基，每组6孔，孵育24h。加入终质量浓度0.5mg/mlMTT溶液，继续培养3h，吸除上清液，每孔加入150µl二甲基亚砜溶液（DMSO），完全溶解后于540nm处检测吸光度值。

1.5细胞上清液NO及PGE2、IL-6、TNF-α水平检测

调整细胞悬液为1×106/ml，加入24孔培养板内。细胞贴壁后，加入SSTW或SSTE，对照组加入等体积RMPI培养基，每组3孔，培养4h后，除对照组外均加入LPS终质量浓度为1µg/ml，继续培养24h后取上清液。Griess法检测NO浓度；ELISA法检测上清液中PGE2、IL-6、TNF-α含量，按照ELISA检测试剂盒说明书分别检测。

1.6蛋白提取及检测

1.6.1COX-2、iNOS总蛋白提取方法

调整细胞悬液为1×106/ml，加入6孔培养板内。细胞贴壁后，加入SSTW或SSTE，对照组加入等体积RMPI培养基，培养4h后，除对照组外加入LPS终质量浓度为1µg/ml，继续培养18h后提取蛋白，提取液为细胞裂解液。

1.6.2MAPK、NF-κB总蛋白提取方法

调整细胞悬液为1×106/ml，加入6孔培养板内。细胞贴壁后，加入SST，对照组加入等体积RMPI培养基，培养4h后，除对照组外加入LPS终质量浓度为1µg/ml。细胞培养1h后提取MAPK蛋白，蛋白提取液为裂解液与蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液比率为100∶3。细胞培养1.5h后提取NF-κB蛋白，使用Nuclearextraction试剂盒，方法参照产品说明书。

1.6.3蛋白检测

每个样品30µg蛋白上样，应用7.5%～12%SDS-PAGE浓缩胶及分离胶进行120V垂直电泳，45V转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h,4℃条件下与一抗溶液孵育过夜，含0.05%Tween-20TBS溶液洗涤后，二抗溶液于室温条件下孵育1h，洗涤后ECL显色。

1.7统计学分析

数据表示为均数±标准差，应用Graphpad统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1HPLC谱图

三黄四物汤的水提取物、乙醇提取物及各单药成分按1.3色谱条件测定，图谱见图1。比较相对峰面积，以排序前3的峰作为主要成分峰进行分析。经对照，SSTW中前3个峰分别来自于黄芩、黄芩和黄连，出峰时间分别为33.5min、42.1min、25.9min，相对峰面积为26.1%、8.8%、4.0%;SSTE中前3个峰分别来自于黄连、当归和黄芩，出峰时间分别为25.5min、54.4min、33.7min，相对峰面积为16.7%、13.6%、8.0%。参照紫外光谱图，SSTW中33.5min、25.9min的峰分别与SSTE中33.7min、25.5min的峰为同一物质，见图1f。

图1HPLC图谱

2.2SSTW和SSTE对RAW264.7细胞存活率的影响

给予SSTW或SSTE终质量浓度分别为0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200µg/ml。SSTW0.78～50µg/ml细胞存活率与正常组无显著差异，100和200µg/ml组细胞存活率显著下降（P<0.001）；而SSTE0.78～12.5µg/ml与正常组细胞存活率无显著差异，25～200µg/ml组细胞存活率显著下降（P<0.001），结果见图2。

图2SSTW和SSTE对RAW264.7细胞存活率的影响

2.3SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞NO含量的影响

给予SSTW组终质量浓度分别为6.25、12.5、25和50µg/ml,SSTE组终浓度分别为1.56、3.13,6.25、12.5µg/ml。LPS诱导后细胞NO含量均显著增加（P<0.001）；与LPS组比较，SSTW和SSTE各组均显著降低NO水平（P<0.01,P<0.001）。SSTW6.25、12.5、25和50µg/ml对NO抑制率分别为12.49%、12.16%、13.39%和15.90%,SSTE1.56、3.13、6.25、12.5µg/ml对NO抑制率分别为15.31%、18.25%、37.54和61.24%。经对比，SSTW2个最高有效浓度25和50µg/ml与SSTE1.56µg/ml的NO抑制率相近，同时SSTE最高有效浓度12.5µg/ml对NO抑制率最强，故各选SSTW25和50µg/ml、SSTE1.56和12.5µg/ml作为后续实验给药浓度。结果见图3。

2.4SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞PGE2、IL-6、TNF-α含量的影响

给予SSTW25和50µg/ml,SSTE1.56和12.5µg/ml。LPS组细胞上清液PGE2、IL-6、TNF-α含量均显著增高（P<0.001）；与LPS组比较，SSTW和SSTE均显著降低细胞上清中PGE2、IL-6、TNF-α水平，并呈剂量依赖性（P<0.001）。其中SSTE12.5µg/ml降低PGE2、IL-6、TNF-α水平均显著强于其他给药组，SSTE1.56µg/ml降低PGE2水平最弱，而降低IL-6、TNF-α水平与SSTW50µg/ml给药组相似。结果见图4。

图3SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞NO含量的影响

图4SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞PGE2、IL-6、TNF-α水平的影响

2.5SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白表达的影响

给予和50µg/ml,SSTE1.56和12.5µg/ml。LPS组iNOS和COX-2蛋白表达均明显增高，而SSTW和SSTE预处理后均明显降低。同时该结果与SSTW和SSTE对NO及PGE2水平影响的实验结果相一致。结果见图5。

2.6SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞MAPK蛋白表达的影响

给予SSTW25和50µg/ml,SSTE1.56和12.5µg/ml。LPS组ERK、JNK、p38磷酸化蛋白表达均明显增高，SSTW预处理后ERK磷酸化蛋白表达明显降低，SSTE预处理后高剂量组ERK,p38磷酸化蛋白表达明显降低。结果见图6。

2.7SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB蛋白表达的影响

给予SSTW25和50µg/ml,SSTE1.56和12.5µg/ml。LPS组IκB-α磷酸化蛋白表达及降解均明显增加，细胞核中p65蛋白表达明显增加而细胞质p65蛋白表达明显降低。SSTW和SSTE预处理后可明显降低IκB-α磷酸化蛋白表达及细胞核p65蛋白表达，同时增加IκB-α总蛋白表达及细胞质中p65蛋白表达。结果见图7。

图5SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白表达的影响

图6SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞MAPK蛋白表达的影响

图7SSTW和SSTE对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB蛋白表达的影响

3、讨论

三黄四物汤在临床上主要治疗热盛、经前吐衄等妇科疾病[1]，但尚无用于妇科炎症的报道。为扩展其临床适用症，我们对其抗炎作用进行了研究。三黄四物汤成分中当归、白芍、川芎、黄连、黄芩均有报道其抗炎作用[2,3,4,5,6,7]，故以此为基础开展实验并探讨其抗炎作用。前期体外实验研究证明三黄四物汤水提物具有良好抗炎症作用。然而考虑到中药煎制中乙醇亦为主要溶剂之一，所以此实验旨在基于抗炎症效果及HPLC成分分析，比较三黄四物汤水和乙醇提取物的差异，以在现实应用中取得具有更佳抗炎疗效提取物的煎制提取方法。

RAW264.7小鼠巨噬细胞是巨噬细胞的一种，常用作为体外炎症模型[8]。脂多糖刺激RAW264.7后产生大量细胞炎性因子如一氧化氮（NO）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、前列腺素E2(PGE2）、环氧合酶-2(COX-2）、白介素类（ILs）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等，引起炎症反应和组织损伤[9,10]。本实验结果表明，SSTW和SSTE均能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO、PGE2、IL-6、TNF-α的水平及iNOS、COX-2蛋白表达，表明SSTW和SSTE具有一定的抗炎作用。SSTE和SSTW相比较，SSTE低浓度与SSTW高浓度降低炎性因子水平效果相似，而SSTE高浓度降低炎性因子水平作用最强，故SSTE比SSTW具有更好的抗炎作用。然而，细胞存活率实验表明，SSTE对于细胞存活率的影响更大，故考虑SSTE具有一定细胞毒性。

LPS诱导RAW264.7细胞后激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatiedproteinkinases,MAPKs）和核转录因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB）信号转导通路[11,12]。MAPK通路蛋白主要包括ERK、p38和JNK，在刺激条件下MAPK通路蛋白磷酸化，并激活NF-κB通路[13,14]。NF-κB是一种控制DNA转录的蛋白复合体，在炎症及免疫反应中起着关键作用，包括调控致炎因子iNOS和COX-2基因的表达[15]。NF-κB被激活后细胞质中IκB-α磷酸化并降解，而p65蛋白则进入细胞核中与DNA结合，促进炎症因子IL-6、TNF-α等的大量表达[16]。本实验中SSTW作用细胞后ERK磷酸化蛋白表达明显降低，而SSTE作用后p38和ERK磷酸化蛋白表达明显降低。表明SSTW可通过ERK通路抑制炎症反应，而SSTE可通过p38和ERK通路抑制炎症反应。SSTW和SSTE均减少IκB-α磷酸化使得IκB-α总蛋白表达增加，同时增加细胞质p65蛋白表达，降低细胞核p65蛋白表达。表明SSTW和SSTE均可通过NF-κB通路抑制炎症的发生。

HPLC分析发现，SSTW中主要成分来自与黄芩和黄连，而SSTE中主要成分来自于黄连、当归和黄芩。对比SSTW成分所占比例，SSTE中黄芩成分比例下降，而黄连和当归成分比例增加，其中该当归提取成分在SSTW中几乎没有，而在SSTE中为主要成分。有研究表明当归油对受损的细胞保护作用具有浓度依赖性，低浓度显示出保护作用，高浓度显示出一定细胞毒作用[7]，与本实验SSTE作用及毒性趋势相一致，考虑该现象可能为当归成分引起。故在三黄四物汤的乙醇煎制提取中控制当归含量使其限于具有细胞保护作用的低浓度，可使得提取物毒性减小且抗炎作用最佳。

综上所述，三黄四物汤水和乙醇提取溶液均有显著抗炎作用，其机制均与炎症通路MAPK和NF-κB有关。然而乙醇提取液比水提取液抗炎作用更好，但细胞毒性也相应增强，可能与SSTE当归成分增加有关。故建议三黄四物汤亦可采用乙醇法煎制提取，同时应注意当归含量及服用剂量。

参考文献：

[1]医宗金鉴:四十四卷/清昊谦著.京师:四库全书馆,清乾隆七年[1742].

[7]朱欢.刘露丝,熊亮,等.当归油化学成分及其神经保护作用研究[J].天然产物研究与开发,2020,32(9):1477-1483.

[12]孙兰,刘莉娜,李家春,等.丹皮酚对LPS诱导小鼠子宫内膜炎NF-kB信号通路的影响[J].兔疫学杂志,2019,35(11):960-964,971.

文章来源：李静,金倫喆.三黄四物汤对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用[J].免疫学杂志,2021,37(07):560-567.