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CAS在急性髓系白血病患者中的表达及临床意义

2022-06-02 231 上传者：管理员

摘要：目的:探讨急性髓系白血病（AML）中的细胞凋亡易感蛋白（CAS）的表达及其与临床特征的相关性。方法:采用蛋白免疫印迹法和免疫组化法检测54例AML患者和24例非血液系统恶性疾病患者骨髓组织中CAS的表达，比较AML组和对照组CAS表达水平，并分析其在AML中的表达与性别、年龄、外周血白细胞数、血红蛋白及血小板计数、骨髓原始细胞比例、ki-67指数、细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层、髓外浸润等临床特征的关系。结果:蛋白免疫印迹法结果显示，AML患者骨髓活检组织中的CAS蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）。免疫组化法检测结果显示，AML组和对照组CAS均主要定位于胞浆。54例AML患者中，CAS高表达者14例（25.9%），对照组24例患者中CAS全部低表达，AML组中CAS高表达率明显高于对照组（P<0.05）。AML患者中CAS高表达组和CAS低表达组之间，预后危险度分层及首次化疗缓解率有差异，且差异有统计学意义（P<0.05）。CAS高表达组的高危患者和首次化疗后未缓解的患者所占比例明显高于CAS低表达组（57.1%vs27.5%,30.8%vs7.9%），低危患者和首次化疗后完全缓解的患者所占比例明显低于CAS低表达组（14.3%vs37.5%,53.8%vs84.2%）。AML患者中，CAS高表达组患者骨髓组织中Ki-67指数高于CAS低表达组（60%vs50%）（P<0.05）。结论:CAS在AML和非血液系统恶性疾病中均定位于细胞浆，且在AML中表达量增加，并与患者细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层、首次化疗后缓解率及ki-67指数相关，提示CAS可能参与了AML的发生、发展。

关键词：
急性髓系白血病
生物标志物
细胞凋亡易感蛋白
预后
骨髓活检
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急性髓系白血病（AML）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，是成人最常见的急性白血病，其特点是骨髓原始幼稚细胞克隆性增殖并抑制正常造血[1,2]。尽管AML对化疗有很高的应答率，但许多患者仍由于对化疗方案耐药而复发，65岁以上的患者死亡率较高，并且近年来死亡率仍未明显下降[3,4,5]。因此，迫切需要找到更多新的生物标志物，以识别高危患者并成为治疗靶点。近年来，细胞凋亡易感蛋白（CAS）在多种实体肿瘤中触发肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭甚至转移的作用得到越来越多的关注，被证实与癌症进展有关[6,7,8,9]。然而，其在血液系统恶性肿瘤中的作用尚缺乏报道。本研究应用蛋白印迹法和免疫组织化学技术检测54例AML患者和24例非血液系统恶性疾病患者骨髓组织CAS的表达水平，并探讨CAS的表达与患者临床特征的关系。

1、资料与方法

1.1 入组患者

纳入2018年6月-2019年9月在山西医科大学第二医院初次确诊AML的患者骨髓组织标本54例，患者中位年龄55.5(12-78）岁，男性29例，女性25例，其中M11例，M220例，M36例，M413例，M514例。所有患者均通过细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学分析确诊为AML，分子生物学及细胞遗传学危险度分层、髓外浸润表现参照《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）》[10]。通过查阅病历获得患者一般临床资料，包括性别、年龄、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、ki-67指数、细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层、髓外浸润及首次化疗后缓解情况。另外选取同期入院的非血液系统恶性疾病患者骨髓组织标本24例。标本一部分用液氮冷冻保存，一部分制成石蜡切片保存。本研究获患者知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 CAS的免疫印迹法检测

配制分离胶后，将测定浓度并进行变性了的蛋白质加入浓缩胶中，行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后进行湿法转膜，转膜后的PVDF膜使用5%脱脂奶粉在室温条件下进行封闭，然后加入CAS一抗（1︰1000,Bioss公司）于4℃条件下孵育过夜，1×TBST洗膜3次，每次5min，加入用1%脱脂奶粉配制的1︰5000稀释的二抗并常温孵育1h，再用1×TBST洗膜3次，加入ECL显色液，于化学发光显色系统曝光拍照。

1.3 CAS的免疫组织化学方法检测

按试剂说明设立阳性对照和空白对照。石蜡切片置于60℃烘箱中2h，置于二甲苯中脱蜡，脱蜡后将玻片依次经过梯度酒精水化，用PBS冲洗3次，每次5min，在3%双氧水中放置20min消化内源性过氧化物酶，在枸橼酸缓冲液中煮沸修复抗原，晾至室温，用PBS冲洗。用正常山羊血清封闭（37℃20min,Bioss公司），吸取多余液体，每张切片滴加70μl稀释的CAS一抗（1︰150,Bioss公司），置于湿盒中，4℃孵育过夜。取出湿盒，室温复温10min,PBS冲洗，吸去组织周围多余PBS，每张切片加70μl相应种属二抗（北京中杉金桥），37℃孵育40min,PBS冲洗，吸去组织周围多余PBS，加入DAB显色液（北京中杉金桥），显微镜下观察结果，适时终止。将苏木素滴加在切片组织上，3min后用自来水冲洗。在1%盐酸酒精溶液中分化15s，自来水冲洗切片。切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，后用中性树胶封片，晾干，显微镜下观察。

1.4 免疫组织化学方法结果的判定

高倍镜下(×400)随机选10个视野，每个视野计数100个细胞。CAS以胞浆出现棕色颗粒为阳性，阳性细胞数<5%为0分，5%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分；阳性强度分为浅棕色1分，棕黄色2分，深褐色3分，两者相乘得出总分值（0-12），分值≥6为CAS高表达，<6为CAS低表达[11]。

1.5 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行数据分析，两独立样本间计数资料比较用χ2检验或Fisher's确切概率法；等级资料比较用秩和检验；两独立样本的定量资料若符合正态分布，以均数±标准差（x±SD）表示，采用t检验；不符合正态分布以中位数（P25-P75）表示，采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。采用ImageJ分析Westernblot条带灰度。

2、结果

2.1 CAS在AML中的表达

分别提取AML和对照组骨髓活检组织中的CAS蛋白，采用免疫印迹的方法检测发现，AML患者骨髓活检组织中的CAS蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）（图1-2）；采用免疫组化方法检测发现，AML组和对照组CAS均主要定位于胞浆，散在或成灶性分布（图3）。54例AML患者中CAS高表达者14例，高表达率为25.9%，其中M11例，M27例，M31例，M42例，M53例。对照组中CAS全部低表达（100%),AML组CAS高表达率明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 CAS的表达对AML患者临床特征的影响

在AML中，CAS表达与患者年龄、性别、髓外浸润无显著相关性（P>0.05）。细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层、首次化疗缓解率在CAS低表达组和CAS高表达组两组间差异有统计学意义（P<0.05）。CAS高表达组预后危险度分层中，高危患者比例明显高于CAS低表达组，低危患者比例明显低于CAS低表达组。有3例患者确诊后未化疗自动出院，其余51例患者首次化疗后39例完全缓解，5例部分缓解，7例未缓解。CAS高表达组中，首次化疗完全缓解的患者所占比例明显低于CAS低表达组，未缓解的患者所占比例明显高于CAS低表达组（表1，图4-5）。

2.3 CAS的表达与AML患者临床指标的关系

在AML患者中CAS高表达组与CAS低表达组患者外周血白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓原始细胞比例差异无统计学意义（P>0.05），而CAS高表达组患者骨髓组织中Ki-67指数高于CAS低表达组，比较差异有统计学意义（P<0.05）（表2，图6）。

3、讨论

CAS又称染色体分离1-样蛋白（CSE1L）、Exportin-2，是酵母染色体分离蛋白CSE1的人类同源物，编码971个氨基酸组成的蛋白质，编码基因位于染色体20q13，这一区域在肿瘤中经常被扩增，并且含有几个可能的癌基因[12,13,14]。CAS在细胞应激反应中合成，定位于细胞质和细胞核，是一种多功能蛋白质，参与细胞凋亡、Importin-α的核质重组，染色体安装，微管相关的细胞增殖，癌细胞的迁移和侵袭，还参与了几种增殖激活蛋白、转录因子、癌基因和肿瘤抑制基因产物的核运输，如p53[8,14,15,16,17]。目前已证明CAS在多种癌症中高表达，并与癌症进展密切相关。

在多数癌症中，CAS发挥着抗肿瘤细胞凋亡、促进侵袭的作用，并与肿瘤分期分级和不良预后有关。有研究发现，CAS除了参与p53凋亡的调控，还参与了肿瘤坏死因子相关配体（TRAIL）诱导的细胞凋亡[18]。CAS可通过转录抑制促凋亡基因RASSF来保护卵巢癌细胞免于死亡[19]。在乳腺癌MCF-7细胞中，CAS通过上调与细胞增殖、凋亡有关的CYP24A1的表达，下调细胞周期信号蛋白CyclinD1表达，在细胞周期中发挥重要作用[6]。有文献报道，CAS与MMP-2共存于细胞膜附近的细胞质区域和侵袭足，CAS过表达促进了MMP-2的分泌，增强了癌细胞的侵袭能力[20]。

CAS也可通过干扰微泡的产生，从而调节黑色素瘤细胞和结直肠癌细胞中MMP-9和MMP-2的表达来影响肿瘤细胞的侵袭性[7,14]。在结肠腺癌中，细胞质CAS与肿瘤分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关[21]。Jiang等[9]研究发现，CAS的胞浆定位似乎预示着Barrett食管的恶性转化，并可能作为Barrett食管患者治疗的预后标志物。此外，胞浆CAS高表达还与肝细胞癌的大血管浸润、喉癌颈腋窝淋巴结转移相关[8,22]。虽然近年来关于CAS的研究日益增多，但大多是实体瘤的体外研究或实验动物模型，其在血液系统恶性肿瘤中的临床研究尚缺乏。

本研究结果显示，AML患者骨髓活检组织中的CAS蛋白表达显著高于对照组，这与先前研究发现的CAS在多种肿瘤，如结直肠癌、黑色素瘤和口腔癌等中表达升高的结果一致[14,21,23]，提示CAS的升高在AML中起重要作用。进一步研究发现，CAS在AML和非血液系统恶性疾病患者骨髓组织中定位于细胞浆，并发现54例AML中CAS高表达率为25.9%，低表达率为74.1%，而24例对照组中CAS全部低表达，并且在AML中，CAS表达与细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层有关，CAS高表达组高危患者所占比例明显高于CAS低表达组，而低危患者所占比例明显低于CAS低表达组，这表明，CAS可能参与AML的发生、发展。此前有研究表明，CAS参与了几种增殖激活蛋白、转录因子、癌基因和肿瘤抑制基因产物的核运输，如p53[17]，推测CAS可能通过调控相关癌基因参与AML的进展。本研究观察到CAS高表达组骨髓组织ki-67指数，即核分裂像数高于CAS低表达组，证实了CAS在骨髓细胞增生中起重要作用。

CAS已被发现在多种肿瘤中促进癌细胞的迁移、浸润，如结直肠癌、卵巢癌、喉癌等[8,19,21]。然而，本研究尚未发现CAS与AML髓外浸润相关，可能原因一是本研究的AML患者病例数较少，后期需扩大病例数进一步验证；二是也有一些研究认为，CAS在某些肿瘤中对肿瘤细胞的迁移与侵袭能力并无影响，如睾丸生殖细胞、骨肉瘤等[24,25]，因此，可能存在CAS对不同部位肿瘤作用的异质性，还需继续深入研究。此外，本研究结果显示，CAS高表达组首次化疗后完全缓解的患者所占比例显著低于CAS低表达组，表明CAS高表达可能预示AML预后不良。曾有研究发现，抗磷酸化CAS抗体可检测抗肿瘤药物索拉非尼作用的肿瘤细胞中CAS水平降低[26]，有助于检测靶向药的治疗反应，但在白血病中尚缺乏相关研究。CAS与AML预后危险度分层和首次化疗缓解率有关，有可能成为评估AML预后的重要因子。

综上所述，本研究结果显示，CAS在AML中的表达量和高表达率高于非血液系统恶性肿瘤患者，且在AML中与ki-67指数、细胞遗传学和分子生物学预后危险度分层和首次化疗缓解率相关，提示CAS参与了AML的发生、发展，可能成为评估AML预后的重要因子，有望为疾病的防治提供一种新思路。

参考文献:

[10]魏辉.成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)[J].中华血波学杂志2017,38()-177-182.

[1]臧红,赵景民,纪冬,等.CAS基因在原发性肝癌组织中的表达及其与HBV感染的关系[J].中华实验和临床病毒学杂志,2012,26(4):285-287.

[24]刘见妮,王鑫,张涵,等.细胞凋亡易感蛋白在睾丸癌中的表达及其对NT.2细胞增殖的影响[J].中国生物制品学杂志,2019,32(11):1234-1238.

文章来源：郭浩然,王鑫,张涵,关坤萍.CAS在急性髓系白血病患者中的表达及临床意义[J].中国实验血液学杂志,2022,30(03):744-749.