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研究桦木酸通过JAK2/STAT3信号通路对白血病细胞的影响

2023-11-19 107 上传者：管理员

摘要：目的探讨桦木酸对白血病HL-60细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法HL-60细胞分为对照组、桦木酸组、AG490组和桦木酸+AG490组，桦木酸组细胞给予60μmol/L桦木酸处理，AG490组细胞给予40μmol/L AG490处理，桦木酸+AG490组细胞先用40μmol/L AG490处理12 h后，再给予60μmol/L桦木酸处理24 h。各组经处理后进行细胞增殖和凋亡检测，以及酪氨酸激酶(JAK2)、信号转导及转录激活因子(STAT3)、p-JAK2和p-STAT3蛋白检测。结果与对照组比较，AG490组和桦木酸组细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，G0/G1期细胞比例升高，p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量降低；与AG490组或桦木酸组比较，桦木酸+AG490组细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，G0/G1期细胞比例升高，p-JAK2和p-STAT3蛋白降低。结论桦木酸可抑制白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡，其可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活发挥作用。

关键词：
JAK2/STAT3信号通路
凋亡
增殖
桦木酸
白血病
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白血病是一种危害人类生命健康的血液和骨髓恶性克隆性疾病，白血病干细胞的不断增殖和凋亡受阻是发生白血病的根源，目前仍无安全有效的治疗白血病的方法[1]。桦木酸是一种天然的五环三萜类化合物，具有抗肿瘤活性，在诱导胃癌细胞凋亡、抑制癌细胞增殖中具有重要作用[2]。桦木酸还可抑制结肠癌细胞迁移和侵袭，发挥抗癌作用[3]。酪氨酸激酶(JAK2)活化后可募集胞浆中信号转导及转录激活因子3(STAT3)单体，使无活性的STAT3形成具有活性的二聚体，并转移进入细胞核与DNA集合，从而发挥信号传导作用[4]。JAK2/STAT3信号通路在急性单核细胞白血病中处于活化状态[5]。研究发现，JAK2和STAT3的活化状态与急性白血病细胞增殖密切相关[6]。体内和体外研究表明，桦木酸通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活发挥抗骨肉瘤的作用[7]。基于以上研究，本研究探讨桦木酸对白血病细胞HL-60恶性生物行为学的影响及其具体机制。

1、材料与方法

1.1 细胞系

人白血病细胞株HL-60购自美国ATCC公司。

1.2 试剂和仪器

桦木酸购自美国Sigma公司；p-JAK2、p-STAT3、JAK2和STAT3抗体购自美国Abcam公司；多功能酶标仪购自美国BD公司；流式细胞仪购自美国Thermo Fisher公司；电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3 不同浓度桦木酸对细胞增殖的影响

常规培养HL-60细胞，第3代细胞离心后调整细胞密度为1×105个/mL,将200μL细胞悬液接种于96孔板，待细胞贴壁生长后，给予不同浓度(0、20、40、60、80和100μmol/L)桦木酸处理细胞，同时设置空白孔(只加入培养基),每个浓度设置5个复孔，培养24 h后，加入CCK-8溶液，继续培养3 h,置于酶标仪上测定450 nm波长处的吸光度(A)值。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将HL-60细胞分为对照组、桦木酸组、AG490组和桦木酸+AG490组，桦木酸组细胞给予60μmol/L桦木酸处理，AG490组细胞给予40μmol/L AG490处理，桦木酸+AG490组细胞先用40μmol/L AG490处理12 h后，再给予60μmol/L桦木酸处理24 h。收集细胞，制成1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μL,细胞贴壁生长后加入CCK-8工作液，继续培养4 h,酶标仪测定吸光度(A)值，计算细胞增殖率。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

按照1.4的方法处理细胞后，取细胞离心，根据试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期

按照1.4的方法处理细胞后，将密度为1×105个/mL的细胞悬液接种于6孔板，每孔200μL,置于培养箱中培养48 h,胰蛋白酶消化，PBS清洗，70%乙醇固定细胞，置于4℃冰箱24 h, PBS清洗，离心弃上清，加入1 mL碘化丙啶，室温孵育，流式细胞仪进行检测。

1.7 蛋白印迹法检测细胞中各蛋白表达

取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，PBS清洗细胞2次，裂解液裂解，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度，煮沸使蛋白变性，120 V电泳2 h, 0.3 A湿转2 h,洗膜，室温封闭1 h, p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3和GAPDH蛋白抗体4℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育1 h,洗膜，曝光，并分析灰度值。

1.8 统计学分析

所有数据采用SPSS 22.0进行分析，计算结果均以(x¯±s)描述，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2、结果

2.1 桦木酸对细胞毒性检测结果

细胞存活率随桦木酸浓度的升高逐渐降低，且具有剂量依赖性(P<0.05),见表1。选用细胞存活率接近70%的桦木酸浓度即60μmol/L用于后续实验。

表1不同浓度桦木酸对细胞存活率的影响(x¯±s,n=3)

2.2 细胞增殖率检测结果

与对照组比较，桦木酸组和AG490组细胞增殖率降低(P<0.05);与桦木酸组比较，桦木酸+AG490组细胞增殖率降低(P<0.05);与AG490组比较，桦木酸+AG490组细胞增殖率降低(P<0.05)。见表2。

表2各组细胞增殖率比较(x¯±s,n=3)

2.3 细胞凋亡率检测结果

与对照组比较，桦木酸组和AG490组细胞凋亡率升高(P<0.05);与桦木酸组比较，桦木酸+AG490组细胞凋亡率升高(P<0.05);与AG490组比较，桦木酸+AG490组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表3。

2.4 细胞周期分布检测结果

与对照组比较，桦木酸组和AG490组G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低(P<0.05);与桦木酸组比较，桦木酸+AG490组G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低(P<0.05);与AG490组比较，桦木酸+AG490组G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低(P<0.05)。见表4。

表3各组细胞凋亡率比较(x¯±s,n=3)

表4各组细胞周期分布(x¯±s,n=3)

2.5 蛋白印迹法检测结果

与对照组比较，桦木酸组和AG490组p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05);与桦木酸组比较，桦木酸+AG490组p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05);与AG490组比较，桦木酸+AG490组p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05)。见表5、图1。

表5各组细胞中p-JAK2、p-STAT3、JAK2和STAT3蛋白相对表达量比较(x¯±s,n=3)

图1细胞中各蛋白表达电泳图

3、讨论

目前临床上针对白血病的治疗方法主要包括化疗和造血干细胞移植，但最大的难题是白血病难治愈和复发率高，因此明确白血病的分子机制，并寻找治疗白血病的分子靶点是治疗白血病的有效方法和途径。桦木酸又名白桦脂酸、白桦酸，具有抗病毒、抗炎以及抗氧化和抗肿瘤等多种药理学活性，桦木酸诱导胃癌细胞凋亡、抑制上皮间质转化、阻碍癌细胞迁移和侵袭[8]。桦木酸通过诱导食管癌细胞凋亡、抑制干细胞特性，增强食管癌细胞对顺铂的敏感性[9]。桦木酸通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬介导的细胞凋亡，并抑制肝细胞癌[10]。本研究采用不同浓度桦木酸处理白血病细胞，结果显示细胞存活率随着桦木酸浓度的升高逐渐降低，且具有依赖性。由此推测，桦木酸在多种恶性肿瘤中具有抗癌作用。

JAK2/STAT3信号通路是细胞因子激活相关的信号转导通路，JAK2受细胞因子激活后可活化STAT3,研究发现，JAK2和STAT3在非小细胞肺癌中被活化[11]。Qiu等[12]研究报道甲基硒酸通过抑制JAK2/STAT3信号通路发挥抗乳腺癌作用。由此可见，JAK2/STAT3信号通路活化与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关。Zhu等[13]研究报道在急性淋巴细胞白血病中，淫羊藿苷通过抑制JAK2和STAT3激活可诱导对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞凋亡，抑制细胞增殖。为探讨JAK2/STAT3信号通路是否在HL-60白血病细胞中发挥作用，本研究通过AG490抑制HL-60细胞中JAK2和STAT3的表达，采用CCK-8法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况，结果表明：抑制JAK2/STAT3信号通路，可阻碍HL-60细胞增殖，诱导HL-60细胞凋亡。此外，流式细胞仪检测细胞周期结果显示：AG490使细胞阻滞在G0/G1期，而S期和G2/M期细胞比例降低。蛋白印迹法检测结果显示：AG490降低p-JAK2和p-STST3蛋白相对表达量。Wu等[14]研究发现桦木酸通过抑制JAK2和STAT3激活发挥抗氧化应激作用，从而减轻T-2毒素诱导的睾丸氧化损伤。为探讨桦木酸是否能通过JAK2/STAT3信号通路发挥抗白血病HL-60细胞增殖，本研究采用AG490和桦木酸联合处理HL-60细胞，结果显示：与单独使用桦木酸或AG490处理相比，联合使用桦木酸和AG490可显著降低细胞增殖率，同时升高细胞凋亡率和G0/G1期细胞比例，而S期和G2/M期细胞比例降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量降低。由以上结果可见：联合使用AG490和桦木酸对HL-60细胞的抑制作用要显著优于单独使用AG490或桦木酸。

综上所述，桦木酸可抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡，其可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路从而阻滞细胞周期发挥作用，可为临床治疗白血病提供理论依据。

参考文献:

[2]丁璐,邵淑丽,何孟奇,等.桦木酸对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响[J].中国应用生理学杂志,2021,37(5):495-499,547.

[3]林晓英,沈阿灵,吴美珠,等.桦木酸通过调节TGF-β/Smad信号通路抑制结肠癌细胞转移的研究[J].康复学报,2020,30(1):58-63.

[7]冯佳,徐海婵,温健,等.桦木酸通过调控JAK2/STAT3信号通路对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制[J].吉林大学学报:医学版,2021,47(3):615-622.

文章来源:康亚伟,钦东煜,罗广立.桦木酸通过JAK2/STAT3信号通路对白血病细胞增殖和凋亡的影响[J].实用癌症杂志,2023,38(11):1750-1753.