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姜黄素联合沙利度胺抑制KG-1细胞增殖及相关作用机制研究

2024-04-03 50 上传者：管理员

摘要：目的：探讨姜黄素联合沙利度胺对急性髓系白血病KG-1细胞增殖、凋亡的影响及与抗凋亡蛋白（Bcl-x L）、信号转导和转录激活因子3(STAT3)的关系。方法：MTT法检测KG-1细胞增殖，筛选姜黄素、沙利度胺的最佳联合浓度；分别采用MTT法、流式细胞术分析姜黄素、沙利度胺单药及两药联用对KG-1细胞增殖、凋亡的影响；实时定量PCR检测单药组、两药联用组、对照组（未处理细胞）的STAT3、Bcl-x L m RNA表达水平。结果：姜黄素和沙利度胺在20-100μmol/L范围内对KG-1细胞增殖的抑制作用均呈浓度依赖性（r=0.657,r=0.681）。姜黄素在作用48 h的IC50值为（42.07±0.50）μmol/L，沙利度胺为（57.01±2.39）μmol/L。姜黄素（40μmol/L）+沙利度胺（60μmol/L）两药联用的细胞增殖抑制率为（86.67±1.53）%，明显高于单用姜黄素的（51.67±1.15）%和单用沙利度胺的（55.33±1.53）%（均P<0.05）。姜黄素、沙利度胺单药及两药联用作用48 h,KG-1细胞凋亡率分别为（18.67±2.08）%、（21.33±2.52）%和（46.67±1.53）%，明显高于对照组的（0.72±0.03）%（均P<0.05）；两药联用组KG-1细胞凋亡率亦明显高于两药单药组（均P<0.05）。与对照组比较，姜黄素、沙利度胺单药组及两药联用组STAT3、Bcl-x L m RNA表达均显著下降（均P<0.05）；与姜黄素、沙利度胺单药组比较，两药联用组STAT3、Bcl-x L m RNA表达亦显著下降（均P<0.05）。结论：姜黄素联合沙利度胺可协同下调STAT3与Bcl-x L表达，抑制KG-1细胞增殖，诱导KG-1细胞凋亡。

关键词：
信号转导和转录激活因子3
姜黄素
急性髓系白血病
抗凋亡蛋白
沙利度胺
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急性髓系白血病是一种异质性恶性疾病，尽管诱导治疗、大剂量化疗效果得到提升，但患者的总生存率仅30%-40%，复发率仍较高[1]。因此，仍然需要探究更优越的治疗方案。沙利度胺可抑制血管生成，单药治疗急性髓系白血病可改善输血依赖，但有效率不足30%[2]。姜黄素是草本植物的产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎作用，既往研究表明其可抑制细胞浸润、逆转耐药，还可上调凋亡蛋白表达，诱导急性髓系白血病KG-1细胞凋亡[3]。但目前国内关于姜黄素联合沙利度胺对KG-1细胞的影响尚无报道。抗凋亡蛋白（Bcl-x L）、信号转导和转录激活因子3(STAT3）在细胞生长、存活、血管生成、细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥着重要作用，调节多种信号通路的转录，有文献报道，Bcl-x L、STAT3在白血病中具有调控作用[4,5]。本研究探讨姜黄素联合沙利度胺对KG-1细胞增殖、凋亡的影响及与Bcl-x L、STAT3的关系，为联合治疗提供实验依据。

一、材料与方法

试剂与仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；姜黄素、二甲基亚砜（DMSO）、5-二苯基溴化四唑（MTT）染料购自美国Sigma公司；沙利度胺购自江苏常州制药有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；STAT3与Bcl-x L抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit逆转录试剂盒购自Takara Biotechnology公司。姜黄素和沙利度胺用DMSO制备成储存液，于-20℃冰箱保存，应用时将RPMI 1640培养基的浓度稀释至相应终浓度。FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；实时定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

细胞株及细胞培养

KG-1细胞购自中科院上海细胞库。细胞培养在RPMI 1640培养液（100 k U/L青霉素、10%胎牛血清、100 mg/L链霉素）中，培养条件为37℃、湿度饱和、5%CO2、细胞悬浮生长，48 h传代1次。取生长良好的细胞（细胞存活率>95%）用于实验。

MTT法检测KG-1细胞增殖

将处于对数生长期的KG-1细胞按5×105个的标准接种到96孔板（各组5复孔、100μl/孔）。根据用药分组，分别加入不同浓度姜黄素（0、20、40、60、80和100μmol/L）以及不同浓度沙利度胺（0、20、40、60、80和100μmol/L），分别作用24、48和72 h后，各孔加50μl的MTT溶液，在37℃和5%CO2下进行4 h的孵育，培养完成后各孔加100μl的DMSO，充分震荡（10 min）使结晶物溶解，后用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。重复3次实验。

流式细胞术分析KG-1细胞凋亡

将5×105的KG-1细胞接种到12孔板，根据用药分组，分别加入姜黄素40μmol/L、沙利度胺60μmol/L、姜黄素40μmol/L+沙利度胺60μmol/L，另设对照组（不用药的未处理细胞）。各组3复孔，持续作用48h,PBS洗涤1次，缓冲液重悬细胞，加入AnnexinⅤ-FITC 5μl混匀，加碘化丙啶2μl，进行20 min的避光反应后上流式细胞仪检测。实验重复3次。

实时定量PCR检测STAT3与Bcl-x L m RNA表达

使用Tripure Isolation Reagent分离总RNA，使用c DNA合成试剂盒反转录。根据基因m RNA序列，使用Primer Express软件设计引物，STAT3引物序列：上游5′-TGGCCCCTTGGATTGAGAGTC-3′，下游5′-GCAGGAAGCGGCTATACTGCT-3′；Bcl-x L引物序列：上游5′-TGGACAATGGACTGGTTG-3′，下游5′-GTAGAGTGGATGGTCAG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。使用SYBR Green Real-time PCR试剂盒定量PCR实验，实验重复3次。PCR扩增：94℃10 min→94℃30 s→56℃15 s→72℃1 min循环40次→72℃10 min。读取阈循环(Ct)值，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt观察组-ΔCt对照组，以2-ΔΔCT法计算STAT3与Bclx L m RNA相对表达水平[6]。

统计学分析

使用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料以（±SD）表示，多组比较行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

姜黄素、沙利度胺分别对KG-1细胞增殖的影响

姜黄素和沙利度胺在20-100μmol/L范围内对KG-1细胞增殖的抑制作用均呈浓度依赖性（r=0.657,r=0.681），即随着浓度增加其对细胞增殖的抑制率增加。姜黄素作用48 h的IC50值为（42.07±0.50）μmol/L，沙利度胺为（57.01±2.39）μmol/L（表1）。

姜黄素联合沙利度胺对KG-1细胞增殖的影响

根据姜黄素、沙利度胺在作用48 h的IC50值，对姜黄素40μmol/L、沙利度胺60μmol/L及其联合作用48 h的增殖抑制情况进行分析，结果显示，姜黄素单药的细胞增殖抑制率为（51.67±1.15）%，沙利度胺单药为（55.33±1.53）%，两药联用为（86.67±1.53）%。两药联用的细胞增殖抑制率高于两药单用，比较差异均有统计学意义（均P<0.05）（图1）。

姜黄素、沙利度胺对KG-1细胞凋亡的影响

姜黄素40μmol/L、沙利度胺60μmol/L及姜黄素40μmol/L+沙利度胺60μmol/L作用48 h,KG-1细胞凋亡率分别（18.67±2.08）%、（21.33±2.52）%和（46.67±1.53）%，对照组细胞凋亡率为（0.72±0.03）%。四组细胞凋亡率比较差异有统计学意义（F=330.102,P<0.05）；两药联用组细胞凋亡率高于单药组及对照组，比较差异有统计学意义（均P<0.05）；而单药组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）（表2，图2）。

姜黄素、沙利度胺对STAT3、Bcl-x L m RNA表达的影响

与对照组比较，姜黄素40μmol/L组、沙利度胺60μmol/L组及两药联用组STAT3、Bcl-x L m RNA表达显著下降（均P<0.05）；与姜黄素、沙利度胺单药组比较，两药联用组STAT3、Bcl-x L m RNA表达亦显著下降（均P<0.05）；而姜黄素、沙利度胺单药组STAT3、Bcl-x L m RNA表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3，图3-4）。

三、讨论

姜黄素是姜黄的活性成分，作为一种天然活性物质具有抗癌、抗氧化、抗炎作用，可靶向调控丝裂原活化蛋白激酶、Wnt、NF-κB等介导的多种细胞信号通路，抑制癌细胞增殖[7]。既往研究显示，姜黄素诱导白血病K562细胞自噬、抑制增殖，其衍生物C212、C1209对白血病细胞有诱导凋亡作用[8]。肿瘤的病理过程复杂，细胞自噬状态下能够免受伤害，也类属于Ⅱ型程序性死亡，有研究发现，姜黄素可上调对白血病细胞的自噬活性，其机制与Caspase-3、Bcl-2有关[9]。目前，多种机制研究发现，姜黄素具有诱导恶性细胞凋亡的能力[10]。本研究结果显示，姜黄素在20-100μmol/L范围内对KG-1细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性，单用姜黄素40μmol/L的细胞增殖抑制率为（51.67±1.15）%，细胞凋亡率为（18.67±2.08）%。且相关资料显示，姜黄素在KG1a、Kasumi-1和U937细胞中能抑制增殖并诱导细胞凋亡和G1/S期阻滞，姜黄素诱导的细胞凋亡与BCL-2 m RNA和蛋白质的表达降低有关[11]。

沙利度胺被称为血管生成的强效抑制剂，可用作治疗恶性肿瘤和免疫疾病，其通过对Bcl-x L、BCL-2等细胞凋亡介导因子的调控控制细胞生长和血管生成、迁移[12]。本研究结果显示，沙利度胺在20-100μmol/L范围内对KG-1细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性，单用沙利度胺60μmol/L的细胞增殖抑制率为（55.33±1.53）%，细胞凋亡率为（21.33±2.52）%，分析与调控细胞凋亡介导因子有关。其中，Bcl-x L能够抗细胞凋亡，在凋亡过程中表现为Bclx L表达下降，进而促使细胞色素C释放，结合凋亡促进因子构成复合体激活Capase-3家族，Capase-3活化提示凋亡不可逆[13,14]。本研究结果显示，沙利度胺60μmol/L组Bcl-x L m RNA表达显著下降，而联合姜黄素40μmol/L能够增强对Bcl-x L表达的抑制作用，分析为联合方案通过Caspase线粒体途径诱导KG1a细胞凋亡。马云等[15]报道，白血病细胞真核翻译起始因子4B在JAK/STAT5/Pim与PI3K/AKT/mTOR通路调控下可影响Bcl-x L表达，诱导细胞凋亡。以上研究提示，白血病治疗机制多样，有待进一步具体研究，以探寻更全面的治疗靶点，提高疗效。

相关资料显示，Bcl-x L表达的增加与STAT3表达的增加相关[16]。STAT3在介导炎症、驱动恶性疾病的发生、发展中是关键因子，其持续性异常激活多数由促炎因子的产物所激发，既往研究在头颈癌、前列腺癌等肿瘤中均报道其具有调控作用[17,18]。文献报道，STAT3与急性髓系白血病危险程度呈正相关（r=0.592),STAT3低表达者生存时间相比STAT3高表达者稍长，STAT3还与免疫分型有关[19]，提示针对急性髓系白血病的治疗应下调STAT3表达。本研究结果显示，与对照组比较，姜黄素40μmol/L组、沙利度胺60μmol/L组及两药联用组STAT3表达显著下降；与姜黄素、沙利度胺单药组比较，两药联用组STAT3表达亦显著下降，提示沙利度胺、姜黄素均可下调STAT3表达，且两药联合可协同增效。也有研究表明，姜黄素、沙利度胺能下调Bclx L的表达，抑制STAT3激活，对STAT3的抑制与Bcl-x L相关，对STAT3、Bcl-x L的影响与PI3K/AKT/m TOR通路相关[20]。且有研究资料显示，通过下调STAT3可诱导细胞凋亡并抑制急性髓系白血病细胞的增殖[21,22]。故两药联合协同抑制KG-1细胞增殖、诱导KG-1细胞凋亡的作用考虑与上述机制有关。

综上所述，姜黄素联合沙利度胺可协同下调STAT3与Bcl-x L的表达水平，抑制急性髓系白血病KG-1细胞增殖，诱导KG-1细胞凋亡，联合治疗可能成为一种新的治疗策略。但其详细机制有待进一步实验明确，需进一步结合活性氧、代谢组学等多方面深入研究。

参考文献:

[6]阮晓红,钟媚共,刘婉敏,等.过表达白血病抑制因子增强子宫内膜癌细胞对化疗药物的耐受.南方医科大学学报,2020,40(1):20-26.

[7]马翠,白天鸽,陈雅琳,等.阿糖胞苷对姜黄素诱导的人急性髓系白血病细胞自噬的影响.中国病理生理杂志,2019,35(8):1409-1415.

[8]范莹娟,周义湘,许建华.姜黄素衍生物C1209对慢性粒细胞白血病细胞的作用及机制研究.中国药学杂志,2021,56(19):1577-1582.

[10]沈云珠,刘碧,黄晓威,等.姜黄素衍生物C212对白血病细胞的抗增殖作用研究.中国临床药理学杂志,2021,37(19):2648-2651.

[15]马云,李婷婷,冯日月,等.急性白血病细胞中JAK/STAT5和PI3K/AKT信号通路对e IF4B的协同调控作用.生物工程学报,2020,36(11):2413-2423.

[19]黄成双,谭梅,张相梅,等.STAT3基因在急性髓系白血病中的表达及临床意义.中国实验血液学杂志,2019,27(1):45-51.

[22]贾祝霞,卢绪章,何金媛,等.STAT3介导耐药白血病细胞抗凋亡和免疫逃逸机制的研究.中国实验血液学杂志,2020,28(6):1796-1803.

基金资助:武汉市医学科研项目(WX21B11);

文章来源:刘娟,黄晔,刘忠.姜黄素联合沙利度胺抑制KG-1细胞增殖及相关作用机制研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):422-427.