人乳头瘤病毒(Human papilloma viruses, HPV)是一种小型环状双链DNA病毒,其基因组分为3个区域,即早期转录区(E区,包含基因E1-E7)、晚期转录区(L区,包含基因L1和L2)和非编码区(也称长控制区,位于L1和E6开放阅读框架之间) [1]。根据编码衣壳蛋白L1区基因序列差异,可将HPV分为不同亚型。目前已检测出约280种亚型,其中有超过200种可感染人类[2,3]。HPV是世界上最常见的性传播病毒,与肛门及生殖器恶性肿瘤和头颈部癌症[4]等全世界约5%的人类癌症有关,现已被确认为是下生殖道浸润前和浸润性癌症发展的必要因素,尤其是宫颈癌[5,6]。宫颈癌是全世界导致女性死亡的第四大癌症,据估计,全世界每年新诊断出的病例为52.8万例[7]。自2006年以来,针对HPV的安全、高效的预防性疫苗一直在市场上销售,但接种率较低,且对于已感染者无效[8]。所以,早期筛查与干预是降低宫颈癌发病率与死亡率的有效手段。与传统方法相比, HPV检测提高了癌前病变的早期检出率,并允许延长筛查间隔时间[9]。目前诊断HPV感染主要依赖于分子生物技术检测HPV的DNA、RNA、癌蛋白等。本综述旨在总结HPV检测的各种常用方法和试剂盒,分析它们在诊断宫颈病变和预测病变进展中的应用,以期为临床选择合适的HPV检测方法提供参考。

1、HPV DNA检测

1.1第二代杂交捕获技术(hybrid capture, HC2)

HC2于1992年获批,是最早获得美国食品药品管理局(food and drug administration, FDA)批准用于HPV检测的方法,其原理基于对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。目前在国际上使用比较广泛,被认为是HPV检测的金标准[9],常作为其他HPV检测方法的参照比较。HC2可检测13种高危HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68) [10],半定量检测,操作方便,无需待检DNA扩增,结果准确且客观性强、重复性好,能避免一定程度的漏诊。然而没有核酸扩增放大步骤,其检测灵敏度降低,不能确定HPV具体型别或区分单一感染和多重感染[11],与低危型HPV (6、11、53、67、70、82等)存在交叉反应,易产生假阳性结果。Yin等[12]的一项meta分析表明, HC2在宫颈癌诊断中灵敏度为83%,特异性为71%。并认为HC2可能提高宫颈癌诊断的准确性,但其检测结果应与常规检测结果和其他临床结果进行平行解读。Koliopoulos等[13]研究表明HC2检测出的阴性结果比细胞学检查出的阴性结果更让人放心。

2018年8月1日, CareTM HPV体外检测诊断试剂完成临床验证,并获得WHO资格认证,可在全球推广。该产品是世界首款通过WHO资格认证的适合发展中国家与地区的宫颈癌筛查体外诊断检测试剂,它基于HC2和磁珠捕获原理,检测14种高危亚型(包括HC2检测的13种高危亚型及HPV66亚型) ,优点是高效、简单、易于操作,对实验人员要求低且不需要特殊实验设施。缺点是不对HPV进行分型和全定量检测。CareTM HPV在精确确定女性是否患有癌症前期宫颈疾病的能力优于常规方法,其敏感度为90%,特异度为84.2%,性能接近发达国家和地区目前普遍使用的HC2。有研究表明, CareTM HPV检测在检测宫颈上皮内瘤变2级(cervical intraepithelial neoplasia grade II, CIN2)的敏感性、阳性预测值和阴性预测值都要显著高于Pap涂片、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)法和阴道镜活检。针对CIN2以及更高级别的病变, CareTM HPV检测与PCR在检测HPV DNA方面无明显差异[14]。

1.2实时荧光定量PCR检测法

传统PCR技术是通过对HPV DNA中某一特定核苷酸序列进行指数级扩增,然后通过凝胶电泳技术对扩增产物进行定性分析。目前有特异性引物和通用引物,前者针对HPV各亚型间E6、E7基因序列的差异设计,后者是依据不同HPV亚型共有的L1开放阅读框架(L1 ORF)中的序列所设计,常用的通用型引物有MY09/11、GP5+/GP6+和SPF10。该方法灵敏度高,但易受污染,假阳性率高,临床应用受限。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的累积进行实时监测DNA扩增反应,最后通过标准曲线对待检样品进行定量分析。该技术能够在单一闭管体系中进行扩增、检测和定量,对特定类型的HPV敏感性极高,不仅实现了自动化,还极大地降低了扩增产物污染的概率,克服了传统PCR的缺点和局限性,用于诊断HPV感染有较好的临床价值。缺点是工作量较大,需专人操作,设备及试剂均较昂贵,多种型别的HPV需多次检测。

2011年4月基于该技术与全自动样品制备的Cobas 4800 HPV检测获FDA批准,因操作方便简单被广泛用于临床。Bottari等[15]研究表明,对CIN2进行检测, HC2和Cobas 4800的灵敏度分别为95.2%和93.7%,特异性分别为72.4%和77.2%。两者检测结果基本一致,都可用于临床检查。而在Tranberg等[16]的临床验证中, Cobas 4800 HPV DNA检测家庭的自我取样具有高度可接受性,而且自我取样与全科医生采集的样本在HPV检测结果方面表现为良好的一致性,由此证明Cobas 4800使用的方便性和高可接受度。Abbott Real-Time HR HPV检测原理与Cobas相同,通过荧光信号分别检测HPV16、HPV18和其他12种高危HPV亚型,同时以β-球蛋白作为内对照,可用于临床检测。BD Onclarity HPV检测也是一种基于PCR技术的检测方法,它可检测14种高危亚型的E6/E7 DNA,还可用于HPV16、18、31、45、51和52的单独基因分型或者(33/58)、(56/59/66)和(35/39/68)三个合并组的单独检测。分析和临床表现的研究表明,这种检测方法在检测CIN2及以上的患者时,与HC2相比,两者的灵敏度和特异性类似[17,18]。2014年,美国食品和药物管理局批准了BD Onclarity HPV检测与液基细胞学(Thinprep cytologic test, TCT)一起用于诊断21岁或以上的女性,以确定其是否需要转去做阴道镜检查。

1.3酶切信号放大技术(Invader Assay)

Invader技术是一种无需进行PCR、能对特定核苷酸序列进行信号放大的定性和定量检测技术。其原理主要是在等温反应下,特异性HPV探针和侵入寡核苷酸片段与靶序列结合,上游探针3′端侵入到下游探针与模板杂交双链中形成一个侵入结构, Cleavase®酶可特异性识别并切割分子结构,释放出HPV探针的5′端碱基片段。该碱基片段同体系中的荧光共振能量转移(FRET)探针结合,再次形成侵入结构,切割FRET探针的猝灭集团并释放出荧光基团,通过分子杂交和化学信号放大使其发出荧光,检测荧光信号来判断靶标是否存在。该技术优点是检测HPV的L1和E6/E7区,避免仅检测L1区造成的假阴性,其采用内部质控评价样本细胞数,可避免因样本量不足引起的假阴性,采用核酸信号扩增检测,不存在扩增产物交叉污染的风险,对试样体积的要求较小[20]。缺点是该检测分型试剂只检测HPV16和18亚型,分组不分型,不定量,不能区别其他亚型感染。

Cervista® HPV HR检测于2009年获得美国FDA批准,可定性检测14种高危HPV亚型,根据基因亲缘关系远近分类,即A5/A6组(HPV51、56和66)、A7组(HPV18、39、45、59和68)和A9组(HPV16、31、33、35、52和58) [19]。Cervista® HPV16/18检测可单独分型检测16和18型HPV。这两种试剂盒均适合用于30岁及以上女性的常规临床宫颈癌筛查以及宫颈病变的辅助确诊,能显著提高宫颈癌及其癌前病变高危人群的检出水平,从而降低宫颈癌的发病率和死亡率以及该病所带来的各种负担。

1.4芯片杂交技术或DNA/RNA微阵列

芯片杂交技术原理是先采用HPV DNA E1区的通用型引物对HPV待测靶标基因进行扩增,然后将扩增产物变性。同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,产生二维DNA探针阵列,与标记的扩增产物杂交,最后通过酶标记显色或荧光标记等方法进行HPV分型检测。该方法可同时检测多种HPV型别,并且能够鉴定多重感染,具有高通量、速度快、所需样品少等优点。与HC2检测的一致率达80.8%,一致性较好。其灵敏度与特异性符合临床HPV分型检测要求,检测结果直观,非常适用于需要检出HPV具体型别的临床需求。然而,由于采用了PCR扩增,并且需要进行开管多步操作,有传统PCR的缺点和局限性,即容易造成交叉污染,有产生假阳性结果的可能。此外,该方法通常不能测定HPV病毒载量。

PapilloCheck HPV检测是一种基于PCR的DNA微阵列系统,可同时检测24种HPV亚型,包括18种高危型(包括HC2检测到的13种高危类型,以及73、82、53、66、70型)和6种低危型(6、11、40、42、43和44/55型)。中国亚能公司的反向斑点杂交法是基于PCR和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术,可对23种HPV亚型(包括HC2检测到的13种高危类型,以及66、73、83、MM4、6、11、42、43和44/55型)进行分型检测。凯普公司HPV试剂盒则是在PCR基础上通过导流杂交基因芯片技术,对21种HPV进行分型检测(比亚能少73、83和MM4,多低危型CP8304)。还有罗氏公司的Linear Array® HPV基因分型检测和Genomica公司的CLART® HPV Line,不同产品可检测的亚型数量与分型不同。

2、HPV RNA检测

检测HPV DNA只是识别感染,而E6和E7高度表达则标志着从感染到癌症的转变。由E6、E7产生的癌蛋白可分别与细胞内p53和pRb结合,使pRb、p53丧失对细胞生长的调节作用,导致细胞永生化,这是恶性肿瘤发生的重要机制。因此,靶向致癌蛋白E6和E7 mRNA比靶向HPV DNA能够更加精确地预测病变向宫颈癌进展风险[21]。HPV E6/E7 mRNA检测可作为子宫颈癌筛查和调查的一种敏感而具体的工具[22]。

Aptima是第一个也是目前唯一一个经FDA认证的用于检测HPV-mRNA的技术,该方法是利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification, TMA)检测HPV E6/E7 mRNA。有Aptima HPV (AHPV)和Aptima HPV16/18/45 Genotype (AHPV GT)两款检测试剂盒,分别于2011年和2012年获得美国FDA批准使用。前者可以检测14种高危型HPV (16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68) ,但不能具体分型。后者可以区分检测HPV16型和18/45型,但对于HPV18/45型的HPV感染只能混合报告是否感染,无法区分具体的型别。多项研究显示,在检测高级CIN方面,与HC2和Cobas 4800 HPV相比, Aptima HPV检测方法具有更大的特异性,且灵敏度没有降低[23,24]。此外, Aptima HPV检测可用于ASC-US和LSIL患者的分诊,以此确定哪些患者需要进一步的阴道镜和活检诊断评估[24]。所以, HPV E6/E7 mRNA检测具有较高的特异性和阳性预测值,可用于预测HPV DNA不显著的感染,有助于避免使用激进的程序(宫颈活检和过度转诊) ,还可以降低患者的焦虑和随访期[25]。但其检测费用更昂贵,而且存在交叉反应。另一个基于核酸序列扩增技术的是Pretect HPV-Proofer,可鉴定5种高危HPV亚型(HPV l6、18、31、33和45型)的E6/E7 mRNA。该方法特异性较高但临床敏感性较低,不适合用于一线的筛查。其优点与Aptima相似,可作为高敏感性HPV检测方法之后的二线分流的方法。

3、HPV致癌蛋白检测

研究发现, 20%～46%的CIN和浸润性宫颈癌(invasive cervical cancer, ICC)患者血清中存在广泛的抗体和HPV早期蛋白,这些生物标志物与疾病严重程度相关[26]。因此发展针对致癌蛋白的免疫组化染色被认为将比其他HPV检测方法有许多潜在的优势。目前,大多数相关的研究都集中在HPV16和HPV18的E6、E7抗体上[26]。它可以证明HPV DNA正在表达,而且存在重要的HPV致癌基因蛋白。与E6/E7的mRNA检测相比,该方法的优点是成本低得多,并且在病理实践中具有更广泛的适用性。因此,抗E6、E7蛋白的可靠抗体的开发可能是未来检测HPV的一种极好的手段[27]。然而,至今尚无商业化试剂在临床检测中应用。

在Ressler等[28]的研究中,抗E7单克隆或多克隆抗体已成功标记组织或细胞中的HPV E7蛋白,并表明其具有作为检测宫颈癌和癌前病变的标记物来诊断HPV的潜能。这一结果为在宫颈癌中直接检测E6/E7癌蛋白的免疫组化研究提供了一个有用的染色方案[29]。Lidqvist等[30]研究表明HPV E7单克隆抗体具有较高的敏感性和特异性,可能具有诊断潜力,可用于鉴定HPV16和18的DNA阳性样本中的E7表达。并认为在未来HPV E7抗体检测有可能成为早期宫颈癌的筛查手段之一,用于区分恶性转化细胞和瞬时感染。针对HPV E6蛋白检测的研究较少,仅有OncoE6TM这种可直接检测HPV16/18 E6癌蛋白分子的试剂,其操作简便且速度快。现已有研究证实该试剂可用于检测高度宫颈病变,具有高特异性[31]。另有研究表明,在大肠埃希菌中产生的功能性抗HPV16 E6的I7单链抗体(scFv) ,纯化后可以用于HPV诱导的恶性肿瘤的诊断和治疗。子宫颈癌细胞的免疫荧光证实了scFvs具有识别细胞核中E6的功能。这种纯化抗体在生理环境中与重组HPV16 E6抗原的结合研究证明了其特异性、敏感性和稳定性[32]。但是, HPV E6蛋白检测目前尚无大规模的临床应用报道,其临床意义还需进一步验证。

4、HPV其他生物学标记物的检测

迄今为止,在高危患者中,除了HPV核酸和细胞学检查外,还没有其他确定的组织血液或阴道生物标志物。识别高危HPV感染和ICC的血清学生物标志物的发现可能对宫颈癌的筛查、检测和治疗产生重大影响。E7蛋白可通过与pRb结合而抑制其活性,进而使E2F转录因子游离并且启动DNA复制,在被感染的细胞中,通过负反馈导致p16INK4a蛋白过表达。故在宫颈癌及其他部位鳞状细胞癌中, p16INK4a的免疫组化常作为检测高致癌风险HPV存在的标志物[33]。此外,还有学者将拓扑异构酶IIα蛋白(topoisomerase II alpha proteins)、端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)以及微染色体维持蛋白2 (minichromosome maintenance protein 2, MCM2)作为生物标记物用于HPV检测。并且已有一些临床研究表明这些标记物对高危型HPV感染有一定的诊断价值。

5、结论与展望

目前有许多临床可用的HPV检测技术,可检测HPV不同的组分,它们在特异性和灵敏度方面各具优势。从本质上来说,这些技术可以分为两大类:靶标扩增技术和信号放大技术。前者包括实时荧光定量检测技术、芯片杂交技术以及mRNA检测方法,后者包括HC2和Invader技术。根据临床实际需要,可选择合适的HPV检测手段。虽然现已确定几乎所有子宫颈癌都是由人乳头瘤病毒感染引起的,但HPV感染到宫颈癌变是漫长而复杂的过程,感染者中只有非常少的人会发展为子宫颈癌。为避免HPV检测呈阳性导致不必要的焦虑和治疗程序,检测结果不仅应明确是否感染,哪些高危HPV感染,还应说明感染处于哪个阶段,致癌可能性的高低,这一直是一个诊断挑战。随着技术与方法的不断进步与创新, HPV检测方法也将会被不断更新完善,未来需要一种更易普及,成本更低,灵敏度、特异性及预测价值更高而操作更简便的HPV检测技术。在此之前,应做好预防知识的普及和疫苗的推广,并时刻关注各地区流行亚型是否改变,以便及时调整HPV检测的主流亚型。

徐帅师,李圆龙,孟璐,张咏梅.人乳头瘤病毒检测方法研究进展[J].中国微生态学杂志,2019,31(07):854-858.

基金:河北省中医药管理局科研计划项目(2018066)