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蒙药三子汤治疗类风湿关节炎的药效学及网络药理学研究

2024-09-11 103 上传者：管理员

摘要：目的：探讨蒙药三子汤对胶原诱导关节炎模型（collagen induced arthritis,CIA）小鼠关节的保护作用及其治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）的作用机制。方法：以CIA小鼠为研究对象，通过关节炎指数评分及关节病理改变观察三子汤对CIA小鼠关节的保护作用。通过中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicines systems pharmacology platform,TCMSP）、Swiss Target Prediction数据库及DisGeNET数据库筛选得到三子汤治疗RA的潜在靶点；应用STRING数据库对潜在靶点进行蛋白-蛋白相互作用分析；应用DAVID数据库对靶点进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析；采用CytoHubba插件进行Hub节点筛选。结果：与模型组比较，三子汤组小鼠关节炎指数评分降低（P<0.05），关节滑膜增生、软骨侵蚀等明显缓解。共筛选得到三子汤活性成分32个，靶点629个，RA疾病靶点1317个，三子汤治疗RA潜在靶点171个；GO及KEGG分析结果显示靶点参与多种与RA相关的功能、生物过程及信号通路；Hub节点筛选明确三子汤治疗RA的关键信号通路为磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、Ras信号通路，关键靶点为双重特异性促分裂原活化蛋白激酶激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1,MAP2K1)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase,RAF1）、MAPK3。结论：蒙药三子汤可缓解CIA小鼠疾病进展；网络药理学分析三子汤可能作用于MAP2K1、MAPK3及其他关键靶点，调节PI3K-Akt、MAPK等信号通路，发挥关节保护作用。

关键词：
RA
三子汤
类风湿关节炎
网络药理学
蒙药
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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病，临床主要表现为对称性关节炎，严重影响患者生活质量[1-2]。目前治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、生物制剂等[3]，上述药物虽然能一定程度缓解RA患者的症状，但具有一定副作用。蒙医作为传统民族医药，在治疗RA方面具有副作用小、疗效确切等特点[4]。因此，寻找治疗RA的蒙药具有重要研究价值。三子汤是由川楝子、诃子、栀子组成的蒙药基础方剂，具有清热、凉血、解毒等功效。既往研究显示，三子汤成分川楝子[5]、诃子[6]、栀子[7]的药理作用均与RA的发生发展相关，但其是否具有抗RA作用及其作用机制仍需深入研究。

网络药理学是近年来兴起的一种研究手段，能够基于网络数据全面解析中药复方多途径、整体性的作用特点[8]。本研究拟通过网络药理学及实验动物研究为三子汤治疗RA提供参考依据。

1、材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 实验动物

SPF级DBA1小鼠，6周龄，雄性，体质量15～18 g，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。光照周期12 h，温度（24±3）℃，相对湿度55%～60%，将小鼠随机分笼，全部自由饮水及进食，适应性喂养2周。

1.1.2 药物、试剂及仪器

三子散（内蒙古蒙药股份有限公司，国药准字Z20026052，规格：3 g/袋）。牛Ⅱ型胶原蛋白（Sigma公司，批号：C7806）；完全弗氏佐剂（Sigma公司，批号：F5881）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）试剂盒（批号：E607318）及甲苯胺蓝染色试剂盒（批号：E670105）均由生工生物工程有限公司提供。XK80-A快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；BM-37XCD显微镜（上海彼爱姆仪器有限公司）。

1.1.3 分组及给药

DBA1小鼠30只，按随机数字表法分为对照组、胶原诱导关节炎（collagen induced arthritis,CIA）模型组、三子汤组，每组10只。模型组及三子汤组均诱导CIA小鼠模型，具体方法：取适量牛Ⅱ型胶原与等体积完全弗氏佐剂充分乳化，制成1 mg/mL乳剂，实验第0天（初次免疫）和第21天（强化免疫）小鼠尾部皮下注射该乳剂，每只100μL。强化免疫后第7天，观察小鼠足爪肿胀情况，记录关节炎指数评分，总分≥1分表示造模成功[9-10]。初次免疫后对照组和模型组小鼠开始灌胃蒸馏水，三子汤组灌胃三子汤药液（0.4 g/kg），按照0.2 mL/10 g灌胃，每日1次，连续3周。

1.1.4 观察指标

1.1.4. 1 关节炎指数评分

强化免疫后第7天开始，每周观察小鼠关节红肿情况，记录关节炎指数评分。评分标准，0分：正常关节；1分：足趾单个关节红肿或脚掌轻微红肿；2分：整个足爪轻微红肿；3分：整个足爪中度红肿；4分：整个足爪严重红肿伴关节变形。单只小鼠关节炎指数评分最高为16分[11]。

1.1.4. 2 关节组织病理学检查

强化免疫后第32天处死各组小鼠，取踝关节，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋（5μm），切片，应用HE染色、甲苯胺蓝染色，观察关节组织病理形态。

1.1.5 统计学方法

应用SPSS 21.0软件处理数据，计量资料以表示，采用单因素方差分析，组间多重比较若方差齐采用SNK-q检验，方差不齐采用Game-Howell检验，检验水准为α=0.05。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 药物活性成分收集和靶点筛选

以单味药名称为关键词在中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicines systems pharmacology platform,TCMSP）数据库[12]中进行成分检索。以“口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%”“类药性（drug-likeness,DL）≥0.18”为条件筛选化合物。应用SwissTargetPrediction数据库[13]预测三子汤潜在靶点。

1.2.2 RA靶点获取

以“Rheumatoid arthritis”为关键词在DisGeNET数据库[14]进行检索，获取与RA相关的靶点，删除重复靶点及“靶点-疾病相关性”得分<1的靶点，找出三子汤潜在靶点与RA靶点交集，即为三子汤治疗RA的潜在靶点。

1.2.3 蛋白质相互作用网络

将潜在靶点信息导入STRING数据库[15]，设置蛋白种属为“Homo sapiens”，获取蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）信息，将其导入Cytoscape软件，绘制PPI网络图。

1.2.4 潜在靶点分析

应用Cytoscape软件的Clue GO插件对潜在治疗靶点进行基因本体论（gene ontology,GO）分析及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析，种属设置为“Homo sapiens”，设置P≤0.05，勾选细胞组分、分子功能、生物过程分析及KEGG分析，应用气泡图对GO分析结果进行可视化处理。应用Cytoscape软件绘制靶点-通路网络。

1.2.5 关键靶点及通路筛选

利用CytoHubba插件对靶点-通路网络进行分析，CytoHubba应用最大集团中心度（maximal clique centrality,MCC）方法，共综合11个拓扑分析方法和6个中心性方法，能够综合多种因素选择关键靶点及通路。

2、结果

2.1 小鼠关节炎指数评分

与模型组相比，强化免疫后第12、17、22、27、32天三子汤组小鼠关节炎指数评分降低（P<0.05）。见图1。

图1 各组小鼠关节炎指数评分

2.2 关节组织病理学表现

对照组小鼠关节面光滑，关节间隙清晰。与对照组比较，模型组关节间隙缩窄，滑膜组织增生并有大量炎性细胞浸润，软骨侵蚀和骨破坏严重。与模型组相比，三子汤组小鼠关节滑膜增生、软骨侵蚀等缓解。见图2。

图2 各组小鼠关节组织病理学表现（HE、甲苯胺蓝，×400)

2.3 网络药理学预测结果

2.3.1 潜在靶点

共检索到川楝子化学成分9个，诃子8个，栀子15个，将基于化合物2D结构预测得到的潜在靶点与RA相关靶点取交集，筛选出共同靶点171个，3种单味药共同作用靶点见表1。

表1 三子汤治疗RA潜在靶点

2.3.2 PPI网络构建

应用STRING数据库分析171个潜在靶点相互作用关系，导入Cytoscape中构建PPI网络。节点颜色代表靶点自由度，颜色越深，自由度越高，结果显示表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3）、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8）、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9）、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2）等靶点在网络中自由度较高。见图3。

图3 三子汤治疗RA潜在靶点PPI网络

2.3.3 靶点富集分析

GO富集分析提示靶点富集于膜筏、第三颗粒等位置，见图4。主要发挥调节金属蛋白酶活性、DNA结合转录因子活性、G蛋白偶联的胺受体活性等功能，见图5。参与炎症反应调节、成纤维细胞增殖调节、自噬调节等生物过程，见图6。KEGG通路富集分析提示靶点参与磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinaseprotein kinase B,PI3K-Akt）信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、趋化因子信号通路等，均与RA的发生发展密切相关，见图7。

图4 三子汤治疗RA潜在靶点细胞组分

图5 三子汤治疗RA潜在靶点主要功能

图7 靶点-信号通路图

2.3.4 Hub节点筛选

筛选得到关键信号通路为：PI3K-Akt、MAPK、Ras；关键靶点为双重特异性促分裂原活化蛋白激酶激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1,MAP2K1）、MAPK3、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAF proto-oncogene serine/threonineprotein kinase,RAF1），见图8。

图8 三子汤治疗RA关键靶点及信号通路

图6 三子汤治疗RA潜在靶点参与的生物过程

3、讨论

蒙药三子汤载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（蒙药分册）。敖丽梅[16]研究发现，不同浓度的三子汤[2.7 g/（kg·d）和5.4 g/（kg·d）]能缓解CIA大鼠关节症状。本研究采用4 g/kg剂量的三子汤同样能够降低CIA小鼠关节炎评分，减少滑膜炎性细胞浸润、减轻软骨基质破坏，缓解关节炎疾病进展。本研究预测到171个潜在治疗靶点，PPI分析发现MAPK3、EGFR、MAPK8、MMP9、PTGS2等靶点在网络中自由度较高，与其他蛋白存在紧密联系，且靶点与RA的炎症反应、血管翳形成、细胞增殖等密切相关[17]，提示三子汤可能通过靶向MAPK3、EGFR、MAPK8、MMP9、PTGS2等发挥关节保护作用。

本研究发现三子汤参与的生物过程及信号通路均与炎症反应有关，其中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路产物MMP9及协同靶点参与软骨基质降解，加剧软骨侵蚀[18]；靶点预测显示三子汤直接作用于MMP9，通过抑制TNF信号通路减少基质金属蛋白酶表达，证明三子汤能通过该途径发挥抑制软骨破坏作用。核因子κB(nuclear factor,NF-κB）在多种免疫反应中发挥炎性因子转录调控作用，被认为是炎症级联反应的始动因素，而三子汤的作用靶点能够调控NF-κB结合及其转录活性。因此，三子汤有较好抗炎作用，且此作用部分通过该途径实现。

通过CytoHubba插件最终确定的关键通路及靶点包括：PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路及MAP2K1、MAPK3、RAF1靶点。关键通路PI3K-Akt能够作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR），促进滑膜成纤维细胞自噬，导致滑膜细胞持续增殖[19]；此外，该信号通路能够刺激TNF-α和白细胞介素6等细胞因子产生，参与破骨细胞分化，导致关节软骨/骨破坏[20]。MAPK信号通路是炎症反应的经典转导途径之一[21]，其中Ras-MAPKs信号通路被激活后能产生大量促炎因子和MMP，加重RA炎症反应[22],MAPK3、MAP2K1、RAF1均为Ras-RAF1-MEK-ERK信号通路的关键蛋白，推测三子汤可能通过上述关键靶点调控MAPK信号通路，延缓RA疾病进展。

本研究结果显示，三子汤可有效缓解CIA小鼠关节炎症；三子汤可作用于MAPK3、MAP2K1、RAF1，通过MAPK、PI3K/Akt、Ras信号通路发挥抗炎，减轻滑膜细胞增殖等作用来治疗RA。

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