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伸筋草与甲氨蝶呤对类风湿性关节炎的疗效及肝毒性比较分析

2021-06-02 363 上传者：管理员

摘要：目的比较伸筋草与甲氨蝶呤治疗大鼠类风湿性关节炎(RA)的疗效及安全性(肝毒性)。方法40只雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、甲氨蝶呤组及伸筋草高、低剂量组。采用牛II型胶原蛋白-不完全弗氏佐剂乳剂诱导复制RA大鼠模型,通过检测各组大鼠后足趾容积、血清中类风湿性因子(RF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平,系统比较伸筋草与甲氨蝶呤治疗RA的疗效。通过检测各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(T-BIL)水平,评价伸筋草与甲氨蝶呤治疗RA时是否伴有肝毒性,对两者的安全性进行比较。结果与对照组相比,模型组大鼠后足趾容积、血清中RF、TNF-α、IL-1β水平均明显升高(P<0.01)；与模型组相比,给予伸筋草高、低剂量和甲氨蝶呤后均可显著降低大鼠后足趾容积及血清中RF、TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平无变化；与模型组相比,甲氨蝶呤组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高(P<0.01),伸筋草高剂量组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平无变化。结论伸筋草治疗RA的疗效与临床常用药甲氨蝶呤相当,未表现出肝毒性,与甲氨蝶呤相比更安全。

关键词：
伸筋草
甲氨蝶呤
类风湿性关节炎
肝毒性
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类风湿性关节炎（RA）是一种慢性、进行性、多发性、侵袭性的，以关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫性疾病[1]，其致残率高，严重危害人类健康[2]。RA相关自身免疫性病理过程中会诱导适应性免疫反应，此过程中会产生类风湿性因子（RF）。同时多种炎症级联反应发生，产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎性因子[3]，给患者带来极大痛苦。目前，RA发病机制尚不明确，西医一般采用非甾体抗炎药、糖皮质激素、改变病情药、生物制剂等药物进行治疗[4,5]。其中甲氨蝶呤是现在RA治疗的基石，被欧洲抗风湿病联盟和美国风湿病学会定位于早期RA治疗的首选用药[6,7,8]，在早期抑制炎症反应、持续控制病情方面发挥巨大作用，但常常伴有肝毒性等副作用[9,10,11]。

伸筋草为石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草，具有祛风散寒、除湿消肿、舒筋活络等功效，主要用于治疗关节疼痛、屈伸不利等症[12]。临床应用历史悠久，疗效确切，无副作用报道。现代研究表明伸筋草具有抗炎、镇痛、免疫调节作用，可降低血清中RF水平，具有治疗RA作用[13,14,15]。鉴于此，本研究对伸筋草与甲氨蝶呤治疗RA的疗效及是否具有肝肾毒性进行系统评价，为伸筋草的推广应用提供科学依据，为开发安全有效的治疗RA创新中药提供研究思路。

1、材料

1.1实验动物

SPF级SD大鼠，6～8周龄，雄性，体质量（200±20)g，购于北京维通利华实验动物中心，许可证SCXK（京）2012-0006，饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心SPF级动物实验室。

1.2药物与试剂

伸筋草购于北京华邈药业有限公司，经天津中医药大学中药鉴定学教研室李天祥教授鉴定为石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草。甲氨喋呤片（2.5mg/片，上海医药集团有限公司信宜制药总厂，批号036150601）。牛II型胶原蛋白（美国Chondrex公司）；不完全弗氏佐剂（美国Chondrex公司）；RF（北京豪迈生物技术有限公司），大鼠IL-1βELISA试剂盒（上海研拓生物科技有限公司，FA01588B），大鼠TNF-αELISA试剂盒（上海研拓生物科技有限公司，FA01721B），丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒、总胆红素（T-BIL）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2、方法

2.1伸筋草提取液的制备

称600g伸筋草，置于10L圆底烧瓶中，分别用10倍量和6倍量的75%乙醇加热回流提取2次，提取时间各为1h，合并2次滤液，浓缩至300mL（生药量2g/mL），得相应提取物[16]。

2.2RA大鼠模型制备、分组及给药

取40只雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、甲氨蝶呤组（0.5mg/kg）、伸筋草低、高剂量组（5、20g/kg）组，每组8只。其中伸筋草低、高剂量给药量分别相当于临床等效剂量的5、20倍，给药质量浓度分别为1、2g/mL。取等体积牛II型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂，混合，30000r/min，匀浆2.5min，制备牛II型胶原-不完全弗氏佐剂乳剂。实验开始时，除对照组外，将200μL牛II型胶原-不完全弗氏佐剂乳剂注射于各组大鼠尾部皮下，进行初次免疫，1周后注射200μL牛II型胶原-不完全弗氏佐剂乳剂进行2次免疫。2次免疫后3d即可获得稳定的RA大鼠模型。模型复制成功后，甲氨蝶呤组和伸筋草高、低剂量组分别ig给予相应药物，伸筋草给药频率为每天1次，甲氨蝶呤为每周2次；对照组和模型组每天给予相同体积生理盐水，连续4周。所有大鼠末次给药2h后进行麻醉取材，腹主动脉取血，离心分取血清。取大鼠肝脏，于10%中性福尔马林溶液中固定48h，置脱钙液中脱钙，石蜡包埋，行HE染色。

2.3治疗RA药效学评价

检测各组大鼠后足趾容积，血清中RF、IL-1β、TNF-α水平，观察各组大鼠后足踝关节病理变化，对伸筋草和甲氨蝶呤治疗RA药效进行评价并进行比较。造模前用纹身液在大鼠后足踝关节处纹出一条横线作为标记线，以保证每次测量位置的一致性。

应用YLS-7B足趾容积测量仪测量大鼠后足趾容积，测量时使标记线与水平线重合，进行读数，每周1次。按试剂盒说明书，采用ELISA方法测定各组大鼠血清中RF、IL-1β、TNF-α水平。

2.4肝毒性评价

ALT、AST、TBIL是临床上肝毒性重要指标[17,18]。取上述分离好的血清，按试剂盒说明书，采用ELISA方法测定各组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平，对各组大鼠是否出现肝毒性进行评价。

2.5统计方法

应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，结果以表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1伸筋草与甲氨蝶呤治疗RA药效比较

3.1.1各组大鼠足趾容积比较

每周测量各组大鼠后足趾容积1次，结果见图1。与对照组相比，模型组大鼠后足趾容积升高，具有极显著差异（P<0.01）。与模型组相比，甲氨蝶呤组和伸筋草高、低剂量组大鼠后足趾容积降低，具有显著差异（P<0.05）。与甲氨蝶呤组相比，伸筋草高、低剂量组大鼠后足趾容积具有降低趋势，但无统计学意义。

3.1.2各组大鼠血清RF水平比较

根据试剂盒说明书，利用ELISA方法检测各组大鼠血清中RF水平，结果见表1。与对照组相比，模型组大鼠血清中RF水平明显升高，具有极显著差异（P<0.01）。与模型组相比，甲氨蝶呤组大鼠血清中RF水平明显下降，具有显著差异（P<0.05）；伸筋草高、低剂量组大鼠血清中RF水平明显下降，具有极显著差异（P<0.01）。与甲氨蝶呤组相比，伸筋草高、低剂量组大鼠血清中RF水平无明显差异。

图1各组大鼠足趾容积

表1各组大鼠血清RF、TNF-α、IL-1β水平

3.1.3各组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较

根据试剂盒说明书，利用ELISA方法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平，结果见表1。与对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明显升高，具有极显著差异（P<0.01）。与模型组相比，甲氨蝶呤组、伸筋草高剂量组、伸筋草低剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明显下降，具有极显著差异（P<0.01）。与甲氨蝶呤组相比，伸筋草高、低剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平无明显差异。

3.2伸筋草与甲氨蝶呤肝毒性比较

根据试剂盒说明书，利用ELISA方法检测各组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平，结果见表2。与对照组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平无统计学差异。与模型组相比，甲氨蝶呤组大鼠血清中ALT、AST水平明显升高，具有极显著差异（P<0.01),TBIL水平无统计学差异；与模型组相比，伸筋草高剂量组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平无明显变化。

对各组大鼠肝脏进行病理检测，结果见图2。对照组肝细胞轮廓清晰，排列整齐，未见明显病变；模型组肝细胞轮廓清晰，排列整齐，未见明显病变；伸筋草高剂量组肝细胞轮廓清晰，排列整齐，未见明显病变；甲氨蝶呤组肝细胞水肿（胞浆疏松化），部分细胞空泡样变性。

表2各组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平

图2各组大鼠肝脏病理检测结果

4、讨论

RA是一种自身免疫性疾病，临床以慢性对称性多关节肿痛伴晨僵等为特征。与RA相关的致病性自身免疫过程诱导适应性免疫反应，可通过自身抗体的产生来识别，如RF等。常见症状为关节肿胀，血清中RF水平升高，因此RF被认为是RA的关键诊断指标之一[19]。同时，也会发生多种促炎级联反应，释放TNF-α、IL-1β等，给患者带来极大痛苦[20,21]。

目前，甲氨蝶呤是治疗RA常用药物，价格低廉，疗效显著，但因不同个体对其的敏感性和耐受性存在差异，常常会引起多种不良反应。有文献报道[22]指出，因其肝毒性等副作用较大致使每周仅可服用1次，严重影响了治疗效果。因此，寻找安全有效的治疗RA药物尤为重要。

伸筋草是治疗RA的一种传统中药，现代药理学研究表明其具有抗炎、抗类风湿作用[23]。本研究对甲氨蝶呤与伸筋草治疗RA的疗效及安全性（肝毒性）比较，发现伸筋草可显著降低RA模型大鼠后足趾容积和血清中RF含量，可显著降低RA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β等炎性因子水平，其疗效与甲氨蝶呤相当。ALT主要分布在肝细胞的胞浆中，相较于AST，是更为准确的肝毒性标志物，并且在一定范围内可以评估肝脏的损伤程度。AST主要分布在肝脏、红细胞和肌肉中。当AST明显升高时提示有肝实质的广泛损害，预后不良。在肝损伤期间，血清中的ALT、AST含量升高，是由于肝细胞膜完整性丧失，膜通透性改变，ALT、AST被释放到血清中且难以进入肝细胞循环系统，从而引起肝细胞损伤[24,25]。TBIL是血红蛋白的分解产物，包括直接胆红素和间接胆红素，TBIL浓度变化与肝损伤程度密切相关[26]。本研究通过检测各组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平及肝脏病理检测，对伸筋草和甲氨蝶呤治疗RA时是否伴有肝损伤进行比较。结果发现，甲氨蝶呤治疗RA时伴有肝毒性。相较于模型组，伸筋草高剂量组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平无变化，肝脏病理显示未发生明显病变，表明伸筋草治疗RA较甲氨蝶呤更具安全性。

本研究结果表明，伸筋草用于治疗RA疗效显著，治疗安全性较高，值得临床推广应用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献：

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