摘要:目的探索中国西南地区人群Fas的rs2234767和rs1800682单核苷酸多态性(SNP)与类风湿性关节炎(RA)及其外周血血清可溶性Fas(sFas)水平的关系。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测183例RA患者和195名健康人群Fas的rs2234767和rs1800682多态性,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血sFas水平,并对结果进行统计学分析。结果RA患者和健康人群Fas的rs2234767和rs1800682多态性差异无统计学意义,RA患者外周血sFas蛋白水平[(2.54±0.41)ng/mL]显著高于健康对照组[(1.57±0.36)ng/mL](P<0.01),健康人群外周血sFas水平和Fas多态性无显著关联,RA组的Fas-670G/G纯合子型的sFas水平[(2.37±0.29)ng/mL]较A/A型[(2.64±0.33)ng/mL]低(P<0.05)。结论中国西南地区人群Fas的多态性与类风湿性关节炎的发生并无显著关系,但RA患者rs1800682基因型与外周血sFas水平有一定关联。
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种临床常见的风湿免疫顽疾,RA的发病与淋巴细胞和组织细胞细胞凋亡异常有关联[1,2,3]。自杀相关蛋白(factorassociatedsuicide,Fas)为肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)家族成员,主要表达于激活的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞等细胞表面,研究表明Fas介导的细胞凋亡与多种自身免疫病的发生发展相关。Fas多态性与系统性红斑狼疮、干燥综合征等自身免疫病相关[4,5,6,7],并伴有血清可溶性Fas(solubleFas,sFas)水平增高[7,8]。RA患者外周血存在sFas表达水平增高[2],但其与Fas多态性的相互关系尚不清楚,且Fas多态性对RA的发生发展的影响尚未完全明确。本研究旨在采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)对类风湿性关节炎患者与健康对照组Fas单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphison,SNP)位点的多态性进行分析,并分析RA患者和健康人群外周血sFas水平,探索RA患者sFas水平与Fas多态性的相互关系。
1、材料与方法
1.1 材料
收集2017年3月1日至2019年9月30日期间前来成都医学院附属医院确诊的类风湿性关节炎患者183例,其中男性59例,女性124例,年龄22~68岁,平均(43.6±11.9)岁。所有病例均符合美国风湿病协会(AmericanRheumatismAssociation,ARA)1987年修订的RA诊断标准。患者的年龄、性别等详细信息均从医疗记录检索,排除伴有其他自身免疫病等疾病。对照组采用同时期年龄和性别相匹配的健康人群195名,其中男性68名,女性127名,年龄21~72岁,平均(45.1±10.2)岁。对照组人群在1周内无发热或接受任何药物治疗,无怀孕、恶性肿瘤、慢性炎性疾病或结缔组织疾病等慢性病史。RA组与健康对照组的性别、年龄、民族、类风湿因子等指标差异均无统计学意义。所有样本均来自生活在西南地区的人群,该研究获得成都医学院医学伦理委员会批准(2017-006),所有研究对象均知情同意。
全外周血基因组DNA提取试剂(北京百泰克生物技术公司);DNA聚合酶(北京天根生化科技公司);限制性内切酶(NewEnglandBiolabs公司)。引物由华大公司合成,sFasELISA试剂(Biosource公司),操作严格按照说明书进行。
1.2 方法
1.2.1 PCR-RFLP检测Fas多态性:
全外周血基因组DNA提取试剂提取样本DNA,PCR-RFLP检测Fas多态性。PCR反应条件:100ng基因组DNA、0.2μmol/LdNTP、上下游引物各0.5μmol/L(Fas-670A/G,上游引物:5′-CTACCTAAGAGCTATCTACCTTC-3′,下游引物:5′-GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3′;Fas-1377G/A上游引物:5′-TGTGTGCACAAGGTGGCGC-3′,下游引物:5′-TGCATCTGTCACTGCATTACCACCA-3′)、2.0mmol/LMgCl2、10mmol/LTrisHCl(pH=8.8)、2.5UDNA聚合酶,总体积25μL。反应温度:94℃预变性5min,94℃变性30s,退火30s(Fas-670A/G为56℃、Fas-1377G/A为55℃),72℃延伸1min,循环35次后,72℃延伸10min。PCR产物经限制性内切酶(Fas-670A/G为MvaⅠ(37℃5h),Fas-1377G/A为BstUⅠ(60℃4h),2.5%琼脂糖凝胶电泳。随机抽取20%的样本和对照,基因测序验证其正确性。
1.2.2 ELISA检测外周血sFas蛋白水平:
抽取类风湿性关节炎患者与健康对照人群每种基因型17~50例/名外周血5mL,静置后分离血清,用ELISA试剂盒检测类风湿性关节炎与健康对照组外周血sFas水平,测试步骤严格按照试剂说明书进行。
1.3 统计学分析
实验数据采用SPSS19.0软件分析,单倍型和等位基因频率用计数资料表示,以Hardy-Weinberg均衡检验分析研究样本的群体代表性。相关数据以均数±标准差(x¯±s)表示,组间比较采用二元逻辑回归分析,基因多态性与类风湿性关节炎之间的风险度采用比值比(oddsratio,OR)和95%置信度(confidenceinterval,CI)评估,基因多态性单倍型组合频率分析采用SHEsis软件进行。多组均数间两两比较采用单因素方差分析。
2、结果
2.1 测序验证PCR-RFLP实验结果
随机分别选取40例RA患者和健康对照者样品的PCR产物进行测序验证,结果与PCR-RFLP结果完全一致(图1)。
2.2 类风湿性关节炎患者组与健康对照组Fas多态性无显著性差异
RA患者组和健康对照组的各基因型均处于Hardy-Weinberg平衡状态。Fas-1377G/A和A/A型和-670G/G纯合子变异在RA患者比健康对照组更常见,但与健康对照组相比,类风湿性关节炎患者Fas多态性差异无统计学意义,年龄与性别调整的回归分析,亦无差异(表1)。
2.3 类风湿性关节炎患者组与健康对照组Fas多态性单倍型组合频率分析
Fas-1377G/A和-670A/G启动子多态性的4种不同单倍型的组合:Fas-1377G与-670A(GA),-1377G与-670G(GG),-1377A与-670G(AG)和-1377A与-670A(AA)的单体型组合频率在RA患者组与健康对照组差异均无统计学意义(表2)。
2.4 类风湿性关节炎患者组与健康对照组外周血sFas蛋白水平检测
RA患者外周血血清sFas蛋白平均水平为(2.54±0.41)ng/mL,显著高于健康对照组的(1.57±0.36)ng/mL(P<0.01),比较健康对照组各基因型相对应的sFas水平,未发现sFas和Fas各基因型之间有显著关联,但RA组Fas-670G/G纯合子型患者的sFas平均水平为(2.37±0.29)ng/mL,比A/A型患者的(2.64±0.33)ng/mL较低(P<0.05)(表3)。
3、讨论
Fas为肿瘤坏死因子(TNF)家族成员,主要表达于激活的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞等细胞表面,Fas与其配体FasL(Fasligand)结合可促使表达Fas的细胞凋亡。FasmRNA通过不同剪切方式可分别产生膜表面Fas和血清可溶性Fas(sFas),因此血清中sFas水平与Fas基因表达水平呈正相关,血清sFas水平可反映出细胞膜表面Fas水平。由于Fas的多态性不同,细胞膜表面Fas水平也有所差异,细胞膜表面Fas表达降低可引起淋巴细胞失衡、免疫机能紊乱、自身免疫耐受的失控而诱发自身免疫病[1,2,3]。
研究发现了Fas多态性与包括系统性狼疮在内的自身免疫性疾病之间的关系,如系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)、多发性硬化、原发性干燥综合征,格林巴利综合征(Guillain-Barresyndrom,GBS)等[4,5,6,7,8,9]。实验结果显示Fas-1377(rs2234767)G/A和-670(rs1800682)A/G的多态性在健康对照组和RA患者组无显著差异,因此Fas-1377G/A和-670A/G多态性与RA疾病的发生似无显著关联,本实验与某些相关文献报道一致[10,11],但也有不同[12],其原因可能与实验人群的地区分布、取样差别及检测人群的规模等有关。本实验发现RA患者与健康者相比,血清sFas水平有显著升高,且RA患者携带有Fas-670G/G基因型者较Fas-670A/A基因型者具有较低的血清sFas水平。相关研究也表明Fas启动子区-670位A/A基因型较G/G基因型有超3倍的结合STAT1的能力,因此γ-干扰素(IFN-γ)可通过激活STAT1促进由Fas-670位A/A基因型受试者而非G/G基因型的受试者分离的单核细胞的Fas表达,在同时使用3种改善病情的抗风湿药物(disease-modifyinganti-rheumaticdrugs,DMARDs)治疗的RA患者中更常伴随有Fas-670G/G纯合体基因型,且血清中的抗CCP抗体增多[10]。结合实验结果,认为sFas水平与Fas-670位基因多态性有一定关系,Fas-670G/G基因型会影响血清sFas及细胞表面Fas表达水平,进一步干扰细胞凋亡从而参与RA的发病进程或影响疾病的严重程度,因此认为RA患者在炎性和细胞因子等刺激下,细胞Fas表达增加可诱导淋巴细胞和多种组织细胞凋亡,但Fas-670G/G纯合体基因型由于影响了Fas表达,淋巴细胞和组织细胞凋亡受阻因而可以促进类风湿性关节炎的病情。综上所述Fas-1377G/A和-670A/G多态性似与RA的发生无显著相关性,但-670G/G基因型可通过影响Fas表达从而影响疾病的发展。
本研究尚存一定缺陷:如类风湿性关节炎组和对照组样本数相对较少;环境因素没有纳入观察范围,没有进行基因多态性与环境相互作用的分析;未将其他生化指标纳入检测范围等。因此需在来自不同地理区域的更大样本数的人群中进行深入研究,以进一步阐明环境因素与类风湿性关节炎发生发展及Fas多态性之间复杂的相互作用。
参考文献:
[1]杨新蕾,张卓莉.多种信号通路在类风湿关节炎发病机制中的研究进展[J].中华风湿病学杂志,2016,20.498-500.
[2]王鑫,魏平.类风湿关节炎患者B细胞上Fas受体表达与疾病活动度相关性研究[J].医学研究杂志,2016,45:138-141.
[3]郭雄飞,王挺,汤立新.miR-29a对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响[J].基础医学与临床,2020,40:9-15.
文章来源:程晓刚,金虹,陈玮,罗丹,单娟,徐艳.西南地区类风湿性关节炎患者Fas单核苷酸多态性与血清sFas水平相关[J].基础医学与临床,2021,41(11):1583-1587.
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A族链球菌(group A Streptococcus,GAS)又称化脓性链球菌,是自然界中一种常见的致病菌,可引起多种疾病,包括浅表性感染、侵袭性感染、毒素介导的疾病以及感染后免疫反应性疾病等。风湿热是GAS感染相关免疫性疾病的典型代表,近年来研究发现,GAS感染还与过敏性紫癜、川崎病、幼年特发性关节炎等多种风湿性疾病发病有一定关联。
2024-04-12类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的,以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病,最终可导致关节畸形和功能丧失,在我国的患病率约为0.28%。改善病情的抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)是治疗RA的首选药物,可通过控制炎症因子的形成来抑制炎症反应,延缓疾病进展。
2024-04-03风湿免疫疾病多为关节、肌肉、骨与软骨的病变,病因多种多样,发病机制尚不完全明确,导致诊断困难,且多数疾病仅能缓解而无法治愈,其表现可以为局部的病变,亦可为系统性、全身性的病变,如无法得到及时的诊治,则有致残或致畸的风险。影像学检查是风湿免疫疾病临床诊断、病情评估、疗效评价及预后监测的重要手段之一。
2024-03-26难治性类风湿关节炎是指经改变病情的慢作用药(disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)治疗6个月或生物制剂维持治疗3个月后,疾病活动评分28关节指数(disease activity score 28-joint count, DAS28)仍处于中、高度水平的类风湿关节炎,其骨质破坏程度严重,关节畸形率及残疾的发病风险高。
2024-03-18类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以侵蚀周围小关节引起关节炎症为主要特征的慢性自身免疫性疾病,可致病人受累关节的肿胀、疼痛,甚至会导致关节畸形和功能丧失,严重影响病人的工作和生活。该病的发病率为0.5%~1%,女性发病多于男性。
2024-02-08类风湿性关节炎(RA)的发病机制尚不明确,患者出现关节畸形、骨质破坏、肌肉萎缩等症状,严重影响其运动功能和生活质量。传统的治疗方式主要为药物治疗,但存在一些副作用和耐药性问题。有研究发现,采取科学的有氧运动、抗阻运动可以改善患者局部功能。近年来,授权教育作为新的康复干预策略受到了越来越多的关注。
2024-02-05类风湿关节炎(RA)是一种常见的侵蚀多关节的慢性自身免疫性疾病,严重者会导致关节畸形及功能障碍。RA活动期时会对人体关节产生不可逆的影响,故及时评估和监测病情对RA患者的治疗和预后有重要作用。临床常用28关节活动度(DAS28)评分判断RA患者活动度,但此方法因计数28个关节和计算评分较复杂,其实用性有限。
2024-01-31风湿免疫疾病多为关节、肌肉、骨与软骨的病变,病因多种多样,发病机制尚不完全明确,导致诊断困难,且多数疾病仅能缓解而无法治愈,其表现可以为局部的病变,亦可为系统性、全身性的病变,如无法得到及时的诊治,则有致残或致畸的风险。影像学检查是风湿免疫疾病临床诊断、病情评估、疗效评价及预后监测的重要手段之一。
2024-01-29风湿免疫病是一类能够累及人体关节、软组织、骨组织的慢性疾病,其患病主要和免疫系统相关,常见疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、风湿类关节炎等,这类疾病对患者日常生活及健康的影响十分严重,而且治疗较为棘手,多表现为病程迁延、反复发作,给患者带来了痛苦[1]。系统性红斑狼疮是比较典型的风湿免疫病,在临床中也比较常见,故本文选取了此类患者作为样本进行观察[2]。
2024-01-29类风湿性关节炎(RA)是临床上常见的免疫性疾病,常表现为游走性疼痛、晨僵、关节畸形等症状。甲氨蝶呤和来氟米特作为临床上常用RA治疗药物,可抑制腺嘌呤核苷酸水平、减轻免疫损伤、缓解临床症状,但易引起骨髓抑制、肝损害、呼吸系统损伤等不良反应。本研究旨在探讨穴位敷贴治疗RA患者,对其关节功能、生化指标、健康状况及临床效果的影响,现报道如下。
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期刊名称:中华风湿病学杂志
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主管单位:中国科学技术协会
主办单位:中华医学会
出版地方:山西
专业分类:医学
国际刊号:1007-7480
国内刊号:14-1217/R
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创刊时间:1997年
发行周期:月刊
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