发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)是一种由大别班达病毒(Dabie bandavirus, DBV)也称发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)引起的一种新型蜱传传染病[1]。临床症状以急性发热为主要特征，可伴有血小板和白细胞的减少。重症患者可在1～2周因多脏器功能衰竭，如休克、呼吸衰竭、弥散性血管内凝血等死亡[2,3]。SFTS首次确定在中国，随后在韩国和日本报道的死亡率可达27%[4,5]。由于其高死亡率和引起大流行传播的潜在可能，SFTS被WHO列为十大优先传染病，迫切需要深入研究。

亚洲长角血蜱是SFTSV的主要传播媒介和宿主[6,7],牛、羊、猪等家养动物是潜在宿主[8,9],人是偶然宿主。SFTSV主要通过蜱叮咬传播给人和动物，也能通过人间接触传播，如接触受感染的血液、唾液和气溶胶[10,11]。家畜、宠物和野生动物逐渐被视为动物传人的风险来源。SFTSV具有引起大流行和医院内传播的能力，可能引起全球公共卫生问题之一[12]。疫苗和治疗药物对预防和治疗SFTS至关重要，但迄今尚无获批使用的SFTSV疫苗。

传染病疫苗种类多样，包括减毒活疫苗、载体疫苗、灭活疫苗、组分疫苗等，其中灭活疫苗具有制备简单、工艺成熟、研发耗时短，免疫过程中无感染性、使用安全等优点，仍是是主要的疫苗类型。灭活疫苗的灭活剂有甲醛、β-丙内酯、二乙烯亚胺等，最常用的是β-丙内酯。β-丙内酯早在1984年被选作灭活狂犬病疫苗的灭活剂正式使用，但其价格昂贵，且对动物有致癌和过敏的风险，因此开发新型灭活剂的需求十分迫切[13,14]。H2O2是一种强氧化剂，与病毒作用后破坏其基因组，核酸单链或双链断裂使病毒丧失复制能力，较为完整地保留抗原结构[15,16]。学者尝试以H2O2作为新型灭活剂，为病毒灭活和疫苗开发提供了新思路[17,18]。本研究利用H2O2灭活SFTSV制备灭活疫苗，以β-丙内酯作对照，从免疫安全性和疫苗有效性2个方面进行了分析，为研发SFTSV灭活疫苗奠定了基础。

1、材料与方法

1材料

1.1细胞和病毒株

非洲绿猴肾细胞(Vero cells)保存于山东大学微生物检验实验室、SFTSV JS2011株获赠于武汉大学公共卫生学院实验室。

1.2主要试剂

30% H2O2购于济南启光科贸有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、β-丙内酯、H2O2酶、0.5%埃文斯蓝染液均购于北京索莱宝科技有限公司；Imject® Alum购于美国赛默飞世尔科技公司；Alexa Fluor 488-山羊抗鼠抗体购于英国abcam公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG2a、HRP标记的山羊抗鼠IgG1抗体均购于英国abcam公司；HRP标记的鼠源Ig抗体购于美国Southern Biotech公司；APC标记的CD19抗体鼠源单克隆抗体(APC-CD19)、FITC标记的CD40鼠源单克隆抗体(FITC-CD40)购于美国BD公司；酶联反应板、Falcon®细胞筛网、流式上样管均购于美国康宁公司；TruStain FcXTM抗鼠CD16/32抗体购于美国BioLegend公司；小鼠淋巴细胞分离液购于深圳市达科为生物技术股份有限公司)。

2方法

2.1病毒的培养

用含10% FBS的DMEM培养Vero细胞。细胞传代18 h后将培养液替换为2% FBS DMEM。按MOI=0.5接种SFTSV后培养于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱。3 d后收集病毒液，离心清除细胞碎片，留取200μL测定病毒滴度。

2.2病毒滴度测定

96孔板接种Vero细胞，1.5×104/孔，置于37℃、5% CO2细胞培养箱培养。用2% FBS DMEM将病毒10倍系列稀释至10-8,接种于Vero细胞，每稀释度设3个复孔，同时设置阴、阳性对照孔，孵育48 h后使用80%丙酮固定16 h。一抗为鼠源SFTSV Gc单克隆抗体，二抗为Alexa Fluor 488-山羊抗鼠抗体，稀释度分别是1∶400与1∶800,抗体孵育条件为37℃1 h。每次孵育抗体后均使用PBS清洗，荧光显微镜下观察、记录荧光孔分布，计算CCID50(Karber法)。

2.3病毒液灭活

取30%H2O2加入病毒液，使H2O2终浓度为3%,4℃静置2 h。加入H2O2酶终止反应，室温20 min, 4℃保存。β-丙内酯灭活剂组按1∶4 000的比例添加β-丙内酯，4℃静置24 h,每隔4～6 h混匀一次，37℃放置2 h水解β-丙内酯，4℃保存。

2.4灭活程度检测

Vero细胞传代至T25细胞瓶，培养液为2% FBS DMEM,18 h后分别接种2种灭活病毒液，每瓶100μL,同时设置对照，阳性对照接种SFTSV JS2011株，阴性对照接种2% FBS DMEM,37℃、5% CO2培养箱培养。如添加灭活病毒液的细胞不出现病变则进行盲传实验。反复冻融第2代和第3代细胞培养物3次，接种Vero细胞，操作同上。观察细胞病变现象，并通过免疫荧光实验检测SFTSV特异性病毒蛋白。

2.5动物免疫

96只6～8周雌性BALB/c小鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司),分至H2O2灭活剂组、β-丙内酯灭活剂组、佐剂组、空白组；灭活病毒液与Imject® Alum 1∶1混合，小鼠右后肢肌肉注射。首次免疫后，对每组小鼠进食量及精神状态进行持续监测，记录体重变化，用于评估灭活疫苗安全性(体重变化率=免疫后每日体重/初始体重×100%),观察期为21 d。首次免疫后14 d加强免疫。免疫方案见表1。实验动物的使用与动物实验方案均按照山东大学实验动物伦理委员会批准的指导方针进行。

2.6中和抗体水平测定

初次免疫后第2、4、8周采集小鼠眼球血并分离血清，每次每组采集6只。经荧光灶减少法测定中和抗体水平。96孔细胞培养板每孔接种1×104 Vero细胞，在培养板第一列孔内加入100μL用DMEM培养基4倍稀释的血清，再2倍比稀释直至2-12(每只设置3个复孔)。50μL 2000 TCID50/mL SFTSV稀释液加入倍比稀释的孔中，留1孔只加病毒，细胞培养箱孵育70 min。将传代培养16 h～18 h的Vero细胞培养液更换为上述血清和病毒互作后的混合液，孵育90 min后再将培养液更换为2% FSB DMEM,细胞培养箱中培养48 h。后续方法同病毒滴度测定。计算50%血清中和终点(Reed-Muench法)。

2.7结合抗体水平测定

初次免疫后2、4、8周每组取5只小鼠采集眼球血，分离血清测定SFTSV特异性Ig和IgG水平。酶联反应板每孔加入100μL浓度为6μg/mL SFTSV全蛋白，4℃过夜。1% BSA 4℃过夜封闭。将血清稀释100倍，再2倍比稀释至最后一列，100μL/孔，4℃过夜。HRP标记抗体每孔添加100μL,4℃过夜。显色液100μL/孔，37℃避光30 min,用1% SDS溶液终止显色。每次加新液体前均用PBST清洗，甩干孔内液体后加样。测定405 nm波长吸光度(A)。全部数值减去空白对照孔吸光度值，若实验组血清A405≥空白组血清A405×2.1,则记为阳性，否则为阴性。

2.8 B细胞募集与活化检测

免疫后第2周，每组取5只BALB/c小鼠，用于脾脏B细胞检测。无菌解剖取脾，添加5 mL小鼠淋巴细胞分离液于3.5 cm细胞培养皿内研磨，之后转移至15 mL离心管并在细胞悬液上覆盖1 mL无血清RPMI 1640培养液，室温800 g离心30 min。吸取位于中间层的淋巴细胞，1 mL PBS洗涤细胞一次。每1×106细胞添加1μL TruStain FcXTM抗鼠CD16/32抗体，4℃孵育20 min,加0.2μL APC-CD19、0.2μL FITC-CD40抗体，同时设单个抗体染色管与空白管，4℃避光孵育30 min, 1 mL PBS洗涤后通过Falcon®细胞筛网，BD FACSCelesta上机检测。

2.9疫苗保护性研究

使用免疫I型干扰素敲除小鼠(IFNAR-/-)评价疫苗保护性。免疫方案如表1所述，每组8只，首次免疫后第14 d加强免疫。免疫后的第4周，均注射100μL SFTSV病毒液，剂量为2×105 TCID50。攻毒后每天称量小鼠体重，监测小鼠的饮食情况、精神状态及临床症状，直至21 d观察期结束。绘制临床症状评分表，记录死亡情况并绘制生存曲线。

2.10数据分析

采用SPSS24.0软件对数据进行分析。采用方差分析、独立样本t检验、Mann-WhitneyU检验统计方法，P<0.05为差异有统计学意义。

表1免疫方案

2、结 果

1病毒培养与滴度测定

获得高滴度SFTSV以制备疫苗。使用2% FBS DMEM培养Vero细胞，0.5 MOI扩增SFTSV,72 h收集上清。经间接免疫荧光实验、Karber法计算病毒滴度为2.37×108 FFU/mL。

2灭活效果检测

对两种灭活剂灭活的病毒液进行盲传实验，检测其是否彻底灭活病毒。以鼠源SFTSV Gc单克隆抗体为一抗，Alexa Fluor 488-山羊抗鼠抗体为二抗，在盲传培养物中均未检测到特异性荧光(图1)。

图1灭活效果检测(标尺50μm)   

3灭活疫苗的安全性评价

观察期内，H2O2灭活剂组、β-丙内酯灭活剂组、佐剂组、空白组小鼠体重变化如图2所示。H2O2灭活剂组、β-丙内酯灭活剂组小鼠体重均呈增长趋势，与佐剂组和空白组相比差异无统计学意义(F=0.3916,P>0.05),表明灭活疫苗不致病。

图3中和抗体效价检测(*P=0.0348<0.05,n=6)  

4中和抗体水平测定

β-丙内酯灭活剂组SFTSV中和抗体效价均值分别为1∶69.33 (2周),1∶282.67 (4周),1∶320 (8周)。H2O2灭活剂组SFTSV中和抗体效价均值分别为1∶186.67 (2周),1∶426.67 (4周),1∶469.33 (8周)。两灭活剂组4周、8周时SFTSV中和抗体效价均较高，H2O2灭活剂组抗体效价均值在2、4、8周时均高于β-丙内酯灭活剂组(图3)。特异性中和抗体的产生表明两疫苗具备保护活性，且H2O2灭活疫苗保护性优于β-丙内酯灭活疫苗。

图4免疫小鼠血清中SFTSV特异性抗体水平  

5结合抗体效价测定

免疫后第2、4、8周，H2O2灭活剂组SFTSV特异性抗体均值分别为1∶6160、1∶3520、1∶4 800;β-丙内酯灭活剂组SFTSV特异性Ig均值分别为1∶7040、1∶4480、1∶4160(图4A)。免疫后2周，两种灭活剂组SFTSV特异性抗体即可达到较高效价并维持8周以上，表明两种灭活疫苗有高效免疫原性。为确定免疫小鼠Th细胞反应类型，采用ELISA法检测小鼠血清内特异性IgG1、IgG2a水平。免疫后第2、4、8周，H2O2灭活剂组小鼠血清中的SFTSV IgG1平均水平分别为1∶1120、1∶6720、1∶3440;而β-丙内酯灭活剂组SFTSV特异性IgG1平均水平分别为1∶1600、1∶9120、1∶6080(图4B)。免疫后第2、4、8周，H2O2灭活剂组小鼠血清中的SFTSV特异性IgG2a平均水平分别为1∶240、1∶460、1∶1060,β-丙内酯灭活剂组小鼠血清中的SFTSV特异性IgG2a平均水平分别为1∶1280、1∶3680、1∶2400(图4C)。在2、4、8周时，IgG2a均值均大于IgG1均值，免疫反应更倾向于Th2型，表明两种SFTSV灭活疫苗能够诱导小鼠产生强大的体液免疫反应(图4D)。

6 B细胞募集与活化情况

B细胞分泌抗体产生免疫效应。图5A为圈门策略，图5B为脾脏中表达CD19、CD40 B细胞的代表性流式图。H2O2灭活剂组CD19、CD40双阳性B细胞平均水平大于β-丙内酯灭活剂组，表明H2O2灭活剂组有更多的B细胞被活化，最高可达19.1%(图5C)。

图5代表性流式图与B细胞活化水平比较  

7疫苗保护性评价

开展感染保护实验，对SFTSV灭活疫苗感染保护效力进行评价。感染后21 d内进行密切观察。空白组和佐剂组小鼠感染后出现体重降低(图6)、体温升高、毛发杂乱、精神萎靡、躯体蜷缩等症状(图7),直至全部死亡(图8)。β-丙内酯灭活剂组、H2O2灭活剂组小鼠感染后短暂出现体重降低(图6)、体温升高、食欲缺乏、毛发凌乱等症状(图7),但较快恢复，且全部存活(图8)。

图6感染SFTSV后小鼠体重变化图(n=8)   

图7感染SFTSV后小鼠临床症状评分图(n=8)   

图8 SFTSV感染保护实验生存曲线图(n=8)

3、讨 论

在中国首次发现SFTSV后，越南、韩国和日本等地也陆续报告了SFTS[19,20,21]。中国和韩国出现日本分支的毒株，日本也发现了中国分支的毒株，表明SFTSV发生跨区域传播[22]。SFTSV为负链分节段RNA病毒。在共同感染期间，SFTSV基因组片段发生交换，当感染单个宿主细胞时，SFTSV将其他病毒的基因组片段打包成新生的杂交病毒粒子[23]。研究表明SFTSV发生3个交换基因组片段的现象[24,25,26,27]。遗传信息改变则导致子代病毒致病性、对外环境抵抗力改变，然而SFTSV基础和疫苗研究还很有限，目前普遍认为SFTSV的血清型只有一种，这为疫苗研究提供了基础。

灭活疫苗使得传染病疫情防控成为可能。β-丙内酯主要作用于病毒粒子中的核酸而对蛋白质结构的影响较小[28]。接种β-丙内酯灭活病毒疫苗后可能出现不良反应，比如过敏反应，1986年研究表明β-丙内酯处理同源血清白蛋白引起豚鼠的全身过敏反应，其频率和严重程度与接种人白蛋白的豚鼠相同[29]。Monath等[30]发现一受试者接受4.8μgβ-丙内酯灭活黄热病疫苗加强免疫后，出现荨麻疹。目前在美国可用的人类二倍体细胞中生产的狂犬病疫苗的一些接受者通常会在加强免疫接种后出现全身过敏反应[29]。生产过程中β-丙内酯暴露对皮肤、黏膜及眼睛有刺激作用，且有致癌的潜在风险。β-丙内酯对病毒的化学灭活可以改变抗原特性，并可能破坏其他病毒制剂中发现的某些表位[31,32]。β-丙内酯性能不稳定，实际生产时还需考量冷藏问题。

目前关于H2O2灭活病毒最先进的方案为HydroVax-II,Quintel等[33,34]报道灭活过程中使用的H2O2浓度大幅降低，添加氧化还原活性金属铜(Cu)与抗病毒化合物美沙松(MZ)后仍表现出快速的灭活动力学和对抗原结构的维持。Quintel等[35]灭活了3种毒株，季节性H1N1、H1N1大流行(2009年)和季节性H3N2,室温下浓度低至1%的H2O2孵育2 h足以抑制病毒复制，体外测定灭活病毒仍然引起免疫原性反应。Marzi等[36]以H2O2为灭活剂制备了复制缺陷型全灭活埃博拉病毒疫苗，在非人灵长类动物中保持抗原性并具有保护作用。H2O2灭活西尼罗河病毒疫苗在年轻和老年小鼠中诱导了强大的中和抗体反应，抗体介导和CD8+ T细胞介导的免疫效果显著，可保护小鼠抵御致命感染[33],已有临床前、I期临床研究数据发表[17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37]。

B细胞承担着关键的体液免疫功能。B细胞发育成熟广泛表达CD19分子[38]。CD40信号促进激活和增殖[39]。因此，免疫后2周，H2O2与β-丙内酯灭活剂组特异性抗体即可达到较高效价。IgG2a/IgG1效价比值反映出免疫反应倾向于体液免疫。免疫后8周H2O2与β-丙内酯灭活剂组SFTSV中和抗体效价均值都达到1∶300以上。H2O2灭活剂组在免疫后2、4、8周中和抗体效价均值均大于β-丙内酯灭活剂组。此外，流式细胞术测定脾脏中CD19、CD40双阳性B细胞，H2O2灭活剂组与β-丙内酯灭活剂组都能促进B细胞活化，H2O2灭活剂组的激活能力更强，这便是H2O2灭活剂组抗体水平较高、H2O2灭活疫苗优于β-丙内酯灭活疫苗的原因。

建立评价候选疫苗有效性的SFTS动物模型对于开发候选疫苗不可或缺。SFTSV通过静脉、肌肉、腹膜或脑内途径感染BALB/c小鼠不产生免疫应答，但会引起小鼠血小板和白细胞减少等症状，不会出现严重的疾病进展与死亡[40,41]。但该病毒可在I型干扰素受体缺陷小鼠(IFNAR-/-)或信号转导和转录激活因子2缺陷(STAT2-/-)C57BL/6小鼠体内有效复制，并导致死亡[40,42,43]。目前鲜有非人灵长类动物模拟人类病毒感染的报道。

综上所述，本研究成功制备了以H2O2和β-丙内酯为灭活剂的2种新型发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗，疫苗具有良好的安全性，动物免疫实验发现两种疫苗均能诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答，并且H2O2作为灭活剂优势显著，为SFTSV灭活疫苗的制备以及优越的灭活剂的选择提供了依据。

基金资助:国家重点研发计划项目(No.2022YFC2305005);国家自然科学基金项目(No.32170154,82102391,82272335,92269116);山东省自然基金(No.ZR2021MC010);

文章来源:杨盼,刘乐乐,田莉,等.新型发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗的制备及免疫原性研究[J].中国病原生物学杂志,2024,19(05):507-513.