肺癌的发病率和死亡人数目前位居全球首位,通常早期可不伴有任何明显的临床症状,当病情逐步进展至中晚期,患者会伴有持续不断的、无法缓解的刺激性咳嗽,咯血,肺部反复感染等症状[1-2]。现代医学认为,肺腺癌最主要的病因是长期主动或被动吸入香烟烟雾[3]。肺腺癌常规治疗包括手术、放疗、化疗和靶向药物治疗,但由于存在个体差异,部分患者身体条件不适合手术治疗和放化疗的方式,靶向药物治疗成为这一类患者的首选方案[4-5]。羽扇豆醇提取于植物,已有研究证实[6-7],羽扇豆醇具有抗氧化、减轻炎症等效果,可抑制肺癌等肿瘤细胞生长[8]。研究证明,细胞分裂周期蛋白25 (cell division cyclin 25,CDC25A)在宫颈癌等多种恶性肿瘤中具有表达升高的表现,通过直接调控细胞生长增殖这一生理过程,促进肿瘤细胞增殖[9]。但其在肺腺癌中的研究并不多见,若能够通过靶向CDC25A调控细胞周期,纠正异常分裂,抑制肿瘤恶性增殖,或许是治疗肺腺癌的新思路。

因此,本研究分析羽扇豆醇靶向CDC25A抑制肺腺癌细胞生物行为的作用机制,期待为临床治疗肺腺癌提供新的线索。

1、材料与方法

1.1材料、仪器与实验动物

CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司),全自动酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司),人肺腺癌A549和Calu-3细胞、RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(批号20181210、20190613、20180726、20200514,武汉益普生物科技),羽扇豆醇(批号为20201208,上海宝曼生物科技),p CDNA3.1-FLAG-CDC25A质粒由武汉益普生物科技有限公司提供(批号202008189),Lipofectamin2000转染试剂(货号11668019,invitrogen公司),CCK-8试剂盒(批号为20201015,上海信裕生物科技);辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗鼠二抗和链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin-pcroxidase complex method,ABC)试剂盒(批号:ZB2305,北京中杉金桥生物),β-actin和CDC25A单克隆抗体(批号分别为ab7817、ab277771,美国Abcam)。

BALC/c裸鼠(长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK (湘) 2022-0011) 18只,雄性,4～6周龄,重约20 g。

1.2羽扇豆醇靶向CDC25A分析

羽扇豆醇的靶点使用Swiss Target (pro>0)和Target Net (取pro>0)进行预测,二者取并集得羽扇豆醇作用靶点。下载TCGA＿LUAD表达矩阵和临床信息,对上述基因进行差异基因分析,取表达上调基因,利用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res.pl)分析与肺腺癌患者总生存期相关的基因,最后选择与肺腺癌患者临床关系最密切的一个基因作进一步研究。

1.3细胞培养与分组

将羽扇豆醇溶于二甲亚砜,配制成储存液,置于-20℃下备用,A549和Calu-3细胞复苏后用含10%FBS的RPMI-1640培养液,置于37℃、p H7.0～7.2、5%CO2培养箱中培养24 h。分别将0和90μmol/L羽扇豆醇孵育的A549和Calu-3细胞设为对照组和羽扇豆醇组,均取对数生长期细胞用于实验。

1.4细胞转染与分组

根据si RNA设计原理,设计合成3对针对CDC25A基因sh RNA的寡核苷酸序列。用脂质体Lipofectamin2000将质粒(p CDNA3.1-FLAG-CDC25A)转染至293T细胞,通过蛋白质印迹进行验证CDC25A蛋白在细胞中的表达情况。接着用3对针对靶基因的si RNA双链和表达CDC25A的质粒分别共转染293T细胞,通过蛋白质印迹检测对基因的沉默效果,筛选RNA干扰的有效靶点。确定有效靶点后,构建表达sh RNA慢病毒载体,转化至感受态细胞DH5α。将处于对数生长期的A549和Calu-3细胞重悬,用Opti-MEM培养基稀释BD转染试剂,分别加入sh RNA慢病毒载体和空白质粒,通过蛋白质印迹进行验证,筛选出转染成功的A549和Calu-3细胞。于37℃、p H 7.0～7.2、5%CO2培养箱中培养肺腺癌A549和Calu-3细胞系,(FBS质量分数为10%的RPMI-1640培养液),隔天换液,维持筛选2周。以转染空白质粒的A549和Calu-3细胞为vector组,稳定沉默CDC25A基因的A549和Calu-3细胞为沉默组,将90μmol/L羽扇豆醇条件下孵育的转染空白质粒的A549和Calu-3细胞设为羽扇豆醇+空白组,90μmol/L羽扇豆醇条件下孵育的稳定沉默CDC25A基因的A549和Calu-3细胞设为羽扇豆醇+沉默组。

1.5 CCK-8法检测细胞生存率

将对数生长期细胞制备成细胞悬液(5×103个/m L)接种于96孔培养板中,每孔100μL,分别与0、30、60、90、150μmol/L的羽扇豆醇进行孵育,培养24 h (培养条件设置:37℃、p H7.0～7.2)。每孔加入10μL CCK-8溶液,继续培养4 h,检测450 nm下的吸光度。参考文献[10],选取恰当的体内应用浓度,连续培养0、1、2、3、4、5后,绘制90μmol/L羽扇豆醇浓度下细胞生存率随时间变化的生长曲线。

1.6克隆形成实验

同法接种细胞于培养板,加入羽扇豆醇(90μmol/L)进行孵育,培养24 h (培养条件设置:37℃、p H 7.0～7.2),待克隆生长到合适大小后,固定染色,显微镜下计数细胞克隆数。

1.7 Transwell检测细胞的侵袭和迁移

使用不含血清的RPMI-1640培养基稀释各组A549和Calu-3细胞(5×105个/m L),本项研究所用羽扇豆醇浓度均为90μmol/L,在无Matrigel基质胶的上室中添加100μL稀释的A549和Calu-3细胞,在有Matrigel基质胶的下室加入500μL含10%FBS的RPMI-1640培养基,24 h后,固定染色,显微镜下记录迁移的细胞数。做细胞侵袭实验时,其余步骤与细胞迁移实验一样,区别在于侵袭实验的上室成分为Matrigel基质胶与无血清培养基,恒温37℃静置4、24 h后,固定染色,显微镜下记录侵袭细胞数。

1.8蛋白质印迹检测CDC25A的表达

取对照组、羽扇豆醇组、沉默组和羽扇豆醇+沉默组的A549和Calu-3细胞,提取总蛋白,BCA法进定量,然后凝胶电泳,转膜,封闭2 h,加一抗,β-actin为内参,4℃孵育过夜,洗膜加二抗,室温孵育2 h,电化学发光显影,比对条带。

1.9裸鼠移植瘤实验

SPF条件下,将0.2 m L人肺腺癌A549细胞株(约8×106个/m L)经皮下注射入裸鼠,构建模型。羽扇豆醇组每隔1天注射一次羽扇豆醇(30 mg/kg),对照组注射等量二甲亚砜。成瘤后,每2天观察瘤体体积,共观察14 d。第14天处死全部裸鼠,称量瘤体质量。

1.10免疫组化法检测移植瘤组织中增殖细胞核抗原(Ki-emycin 67,Ki67)和CDC25A的蛋白表达

常规固定、制作移植瘤切片,ABC试剂盒检测Ki67表达,免疫组化检测CDC25A表达,棕色为阳性细胞,统计Ki67和CDC252A阳性细胞数,计算阳性细胞率。阳性细胞率(%)=阳性细胞数目/总细胞计数×100%。

1.11统计学处理

计量资料以表示,SPSS 17.0为本研究统计学分析软件,统计学方法为单因素方差分析。

2、结果

2.1 CDC25A与肺腺癌病理特征

网络药理学分析得出CDC25A基因可能为羽扇豆醇靶点之一,且与肺腺癌临床表型密切相关(图1A)。

下载TCGA＿LUAD表达矩阵和临床信息,对该63个基因进行差异基因分析,其中19个基因表达水平上调(log FC>1,P<0.05)。在线分析工具Ualcan分析发现UGT2B7和CDC25A两个基因与肺腺癌患者总生存期相关。进一步分析TCGA＿LU-AD数据库中这2个基因表达水平与肺腺癌分期、远端转移以及淋巴结转移等的关系,发现CDC25A基因与LUAD患者临床关系密切,因此本研究选择CDC25A基因进一步研究(图1B)。比起在癌旁组织中的表达,CDC25A蛋白在LUAD癌组织中表达明显升高(P<0.05),且其表达量与肿瘤浸润、分期、远端转移、淋巴结转移、复发、预后情况和生存率有关(P<0.05),CDC25A蛋白表达水平高的细胞生存率明显低于CDC25A蛋白表达水平低的细胞生存率(P<0.05)(图1C～J)。

2.2羽扇豆醇体外抑制肺腺癌细胞增殖

CCK-8实验结果显示,羽扇豆醇浓度越高,作用时间越长,LUAD癌细胞A549和Calu-3的细胞生存率越低(图2A～D)。羽扇豆醇体外抑制肺腺癌细胞增殖的IC50为(95.82±11.17)μmol/L,因此选择90μmol/L为体内应用浓度。羽扇豆醇能使A549和Calu-3细胞克隆数明显下降(P<0.05)(图2E、F)。

2.3羽扇豆醇体外抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭

Transwell实验显示,羽扇豆醇组发生侵袭和迁移的A549和Calu-3细胞数量均明显低于对照组(P<0.05)(图3A～D)。

图1 CDC25A与肺腺癌临床病理特征的关系

图2羽扇豆醇体外抑制肺腺癌细胞增殖

2.4羽扇豆醇体内抑制肺腺癌细胞增殖

裸鼠移植瘤实验显示,随着时间增加,肿瘤体积明显增加(P<0.05),羽扇豆醇组的移植瘤组织体积和质量均明显小于对照组(P<0.05)(图4A～C)。

免疫组化结果显示,羽扇豆醇组Ki67表达及直接作用靶点CDC25A蛋白表达均相较于对照组明显下降(P<0.05)(图4D、E)。

图3羽扇豆醇体外抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭(×100)

A:A549细胞迁移数;B:Calu-3细胞迁移数;C:A549细胞侵袭数;D:Calu-3细胞侵袭数。1:对照组;2:羽扇豆醇组。与对照组比较,*P<0.05。

图4羽扇豆醇体内抑制肺腺癌细胞增殖(×100)

2.5羽扇豆醇抑制CDC25A表达

蛋白质印迹显示,羽扇豆醇能够抑制A549和Calu-3细胞系中CDC25A的表达,并且与时间增加和浓度正相关(P<0.05)(图5A、B)。

图5羽扇豆醇抑制CDC25A表达

2.6羽扇豆醇通过CDC25A抑制肺腺癌恶性表型

构建稳定沉默CDC25A基因的表达载体,WB实验验证转染成功(图6A)。

与vector组比较,羽扇豆醇组、沉默组和羽扇豆醇+沉默组A549和Calu-3细胞中CDC25A表达水平、细胞活性和细胞克隆数明显降低(P<0.05)(图6B～D)。Transwell显示,与vector组比较,羽扇豆醇组、沉默组和羽扇豆醇+沉默组的A549和Calu-3细胞迁移和细胞侵袭数明显下降(P<0.05)(图6E、F)。

图6羽扇豆醇通过CDC25A抑制肺腺癌恶性表型

3、讨论

肺腺癌驱动基因突变的情况很多,基因突变往往伴随相应下游蛋白、因子的活性改变,因此找寻肺腺癌的相关作用靶点,探索其作用机制具有重要的临床意义[11]。

本研究结果显示,肺腺癌癌细胞A549和Calu-3的细胞生存率、细胞克隆数随着羽扇豆醇浓度升高有明显降低的表现,说明羽扇豆醇可以有效抑制肺腺癌癌细胞A549和Calu-3恶性增殖等恶性生物学行为,并且该抑制效果呈时间和浓度依赖性。有研究显示[12-13],羽扇豆醇因具备诱导肿瘤细胞分化和促其凋亡而具有良好的抗癌活性。细胞癌变可以表现出细胞恶性增殖,若肿瘤细胞大量凋亡,其增长速度将会延缓,表现为抑制肿瘤生长,合理猜测羽扇豆醇或可通过促使肺腺癌癌细胞凋亡,从而抑制肺腺癌癌细胞A549和Calu-3恶性增殖,具体机制需另外做细胞凋亡实验检测。

本研究中,羽扇豆醇组移植瘤组织体积和质量,Ki67和CDC25A蛋白的表达量均明显降低。卢艳丽等[14]的研究指出,肺腺癌患者的CT征象与Ki67蛋白表达量有关,可以此对肺腺癌进行早期诊断。本研究结果说明使用羽扇豆醇干预后,Ki67表达明显下调,再次证明羽扇豆醇可抑制肺腺癌细胞恶性增殖。CDC25A可调控细胞周期,研究表明,过量CDC25A会引起细胞生长失控,为细胞恶性转化和肿瘤恶性增殖提供病理条件,因此在恶性肿瘤中CDC25A往往被检测出高表达。移植瘤组织中CDC25A蛋白阳性率明显升高,说明CDC25A蛋白在移植瘤组织中的表达上升,使用羽扇豆醇干预后,CDC25A蛋白表达水平下降,提示羽扇豆醇可能通过调控CDC25A蛋白表达抑制肺腺癌恶性生物行为。

本研究结果显示,羽扇豆醇组、沉默组和羽扇豆醇+沉默组A549和Calu-3细胞中CDC25A蛋白表达水平、细胞活性、细胞克隆数、细胞迁移和侵袭数明显降低,在过表达组中又明显升高,说明沉默CDC25A基因可以抑制肿瘤活性,也证实羽扇豆醇可以通过调控CDC25A蛋白表达,发挥明显抑制肺腺癌癌细胞的细胞活性,并抑制其恶性增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为的作用。既往研究显示[15-16],CDC25A磷酸酶可以促进细胞进入有丝分裂,使之具有无限增殖的能力,因而与恶性肿瘤的发生发展有密切关联。另有研究证实[10,17],羽扇豆醇可以通过沉默ST3Gal3等基因或调控c-Jun/mi R21等信号通路影响下游靶基因m RNA表达,从而抑制肿瘤细胞侵袭与迁移,该机制能够部分解释本研究中羽扇豆醇组A549和Calu-3细胞迁移和细胞侵袭数明显下降的原因。

综上所述,羽扇豆醇可能通过靶向作用于CDC25A,下调肺腺癌癌细胞CDC25A蛋白表达水平,从而抑制其恶性增殖,阻碍癌细胞转移与侵袭,发挥抗肺腺癌恶性生物学的治疗作用。

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基金资助:湖南省卫生健康委科研计划项目(No.D202309046366)~~;

文章来源:朱叶新,邓梨平.羽扇豆醇靶向CDC25A对肺腺癌细胞增殖､迁移和侵袭的影响[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):16-22.