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姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放疗增敏的影响

2020-09-29 301 上传者：管理员

摘要：目的：研究姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放疗增敏的机制。方法：体外培养人肺癌细胞,并分为空白组、对照组(多西紫杉醇50mg•mL-1)和低(姜黄素20μmol•L-1+多西紫杉醇50mg•mL-1)、高剂量实验组(姜黄素60μmol•L-1+多西紫杉醇50mg•mL-1)。用噻唑蓝(MTT)观察姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞生长的抑制作用,用克隆形成实验观察其对放射敏感性的影响,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期影响,用WesternBolt检测Bcl-2、Bax、P53、P21表达情况。结果：空白组、对照组和低、高剂量实验组的平均致死剂量(D0)分别为(3.1±0.3),(2.6±0.3),(2.1±0.2)和(1.8±0.2)Gy,准域剂量(Dq)分别为(3.1±0.3),(1.9±0.2),(1.3±0.1)和(1.0±0.1)Gy,细胞存活分数(SF2)分别为(86±8)%,(73±7)%,(65±6)%和(50±5)%,G0/G1期细胞数目分别为(45.23±2.11)%,(42.88±2.78)%,(37.86±2.76)%和(27.33±2.49)%,Bcl-2蛋白表达量分别为1.74±0.11,1.49±0.10,0.90±0.10,0.59±0.09,差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组的增敏比(SERDq)、平均致死剂量时增敏比(SERD0)、细胞凋亡率、G2/M期细胞数目、Bax、P53、P21蛋白表达量与低、高剂量实验组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论：姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放疗增敏其作用机制与肿瘤细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关,且呈浓度依赖性。

关键词：
多西紫杉醇
姜黄素
放疗增敏
肺癌
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近年来肺癌是威胁人类生命和健康最严重的恶性肿瘤之一[1]。目前对于早期肺癌主要的治疗手段为手术,同时放射治疗是重要的辅助治疗手段。多西紫杉醇是目前常见的辅助放疗的药物,除此之外中药也可作为放化疗的辅助药物。姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜科植物姜黄中提取的β-二酮多酚类化合物,具抗氧化、无诱变性等基本特性[2,3]。本文旨在研究姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放疗增敏的影响。

材料与方法

1材料

细胞人肺癌细胞,购自中国科学院细胞库。

药品与试剂姜黄素,纯度:≥95%,规格:每支10mg,批号:20171215-A,购自北京信达方舟科技发展有限公司;多西紫杉醇,纯度:>98%,规格:每支20mg,批号:20180112-ST,购自南京道斯夫生物科技有限公司。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)试剂盒,均购自武汉华联科有限公司;P53、P21试剂盒,购自苏州江莱ELISA研究所;FITC标记AnnexinV(AnnexinV-FITC)凋亡检测试剂盒,购自杭州四季青生物工程材料有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒,购自江苏碧云天生物技术有限公司。

仪器SG-51正置金相显微镜,购自上海光学仪器厂;722荧光分光光度计,购自上海仪电分析仪器有限公司;7020全自动生化分析仪,购自日本日立公司;AttuneNxT流式细胞仪,购自赛默飞世尔科技有限公司。

2方法

2.1细胞培养、分组与给药方法

将人肺癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2条件下的培养箱内培养,取对数生长期细胞进行实验。根据前人研究得出不同照射剂量X线照射后,发现射线对人肺癌细胞有抑制作用,计算出细胞存活分数为50%的照射剂量约为(4.18±1.02)Gy,本实验中选照射剂量为4Gy。实验分组为空白组、对照组和低、高剂量实验组。空白组不添加任何辅助药物,对照组给予多西紫杉醇50mg·mL-1+放疗,低剂量实验组给予姜黄素20μmol·L-1+多西紫杉醇50mg·mL-1+放疗,高剂量实验组给予姜黄素60μmol·L-1+多西紫杉醇50mg·mL-1+放疗。

2.2以MTT法检测细胞的增殖情况[4]4]

接种于96孔板中,培养液预处理1d,用不同剂量放疗后加入MTT溶液,检测光密度(OD)值。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

2.3以克隆形成实验测定细胞放射敏感性[5]5]

接种于96孔板中,按照药物分组处理后使用放疗剂量分别为2,4,6,8Gy,照射完毕后每孔50个细胞分别接、固定、染色、室温干燥。倒置显微镜下观察,细胞存活分数=实验组集落形成数/对照组集落形成数。

使用单击多靶模型方程:细胞存活数。拟合细胞存活曲线,计算放射增敏比,实验重复3次,取平均值。增敏比=对照组D0值/实验组D0值。其中D0为平均致死剂量;D为实验检测的致死剂量;e为自然常数,其值约为2.71828。

2.4以流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期影响[6]6]

将空白组、对照组和低、高剂量实验组的人肺癌细胞使用胰酶消化后,4℃下以3000r·min-1离心5min,将得到的细胞后加入BindingBuffer重悬细胞100μL,加入AnnexinV-FITC5μL和PI5μL,轻轻混匀;室温避光孵育15min并加入BindingBuffer400μL,用流式细胞仪检测。

2.5以WesternBolt法检测Bcl-2、Bax、P53、P21表达情况[7]7]

按照Bcl-2、Bax、P53、P21试剂盒的使用方法操作。以Bcl-2、Bax、P53、P21与β-actin的OD比值表示蛋白表达水平。

3统计学处理

数据用SPSS20.0软件进行统计处理。计量资料用表示,用方差分析比较。

结果

1MTT观察姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞生长的抑制作用

放疗照射量为2,4,6,8Gy时,相比空白组,对照组和低、高剂量实验组人肺癌细胞存活率显著降低,且高剂量实验组存活率显著低于对照组和低剂量实验组,差异有统计学意义(P<0.01);放疗照射量为8Gy细胞存活率显著低于6Gy,放疗照射量为4Gy细胞存活率显著低于2Gy(P<0.01),见表1。

2姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放射敏感性的影响

相比空白组,对照组和低、高剂量实验组平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)、细胞存活分数(SF2)显著下降,且高剂实验量组下降显著低于对照组和低剂量实验组(P<0.01);相比对照组,低、高剂量实验组放疗增敏比(SERDq)、平均致死剂量时放疗增敏比(SERD0)显著升高,且高剂量实验组显著高于低剂量实验组(P<0.01),见表2。

3各组细胞凋亡率及细胞周期比较

空白组、对照组和低、高剂量实验组细胞凋亡率分别为(12.50±1.25)%,(25.52±3.99)%,(30.25±4.01)%,(40.69±4.99)%,对照组和低、高剂量实验组细胞凋亡率较空白组升高,低、高剂量实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且高剂量组细胞凋亡率显著高于低剂量实验组(均P<0.05)。

相比空白组,人肺癌细胞G0/G1期显著减少,且低剂量实验组显著低于对照组,高剂量实验组显著低于低剂量实验组,差异均有统计学意义(均P<0.01);对照组S期细胞显著增加(P<0.01),低、高剂量实验组显著减少,且高剂实验量组显著低于低剂量实验组,差异有统计学意义(均P<0.01);对照组和低、高剂量实验组G2/M期细胞显著增加,且低剂量实验组显著高于对照组,高剂量实验组显著高于低剂量实验组,差异均有统计学意义(均P<0.01),见表3。

4姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞Bcl-2、Bax、P53、P21表达影响

空白组Bcl-2、Bax、P53、P21蛋白相对表达量分别为1.74±0.11,0.62±0.25,0.49±0.01,0.50±0.08,对照组分别为1.49±0.10,0.80±0.05,0.84±0.05,0.83±0.05,低剂量实验组分别为0.90±0.10,1.45±0.05,1.28±0.75,1.30±0.05,高剂量实验组分别为0.59±0.09,1.52±0.04,1.46±0.04,1.53±0.06。对照组和低、高剂量实验组与空白组比较,差异均有统计学意义,低剂量实验组与对照组比较,差异均有统计学意义,高剂量实验组与低剂量实验组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表1各组胰腺癌细胞存活率比较

表2各组放射敏感性比较

表3姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞周期影响

讨论

本实验检测细胞放射敏感性发现,相比空白组,对照组D0、Dq显著减小,说明单独使用多西紫杉醇可以一定程度提高人肺癌细胞的放射敏感性,使用姜黄素联合多西紫杉醇处理后,不仅D0、Dq显著减小,SERDq、SERD0显著增大,说明姜黄素联合多西紫杉醇可以提高人肺癌细胞的放射敏感性。

Bcl-2家族也是一种常见的凋亡控制基因[8]。本实验发现,相比空白组和对照组,实验组Bcl-2表达显著下降时Bax表达显著上升,说明了姜黄素联合多西紫杉醇提高人肺癌细胞的放射敏感性可能和促进癌细胞凋亡相关。这可能是因为姜黄素联合多西紫杉醇处理后促进肺癌细胞的Bax蛋白表达,使肺癌细胞的凋亡启动,导致细胞凋亡的连锁反应,促进肺癌细胞的凋亡。

本实验结果显示,使用姜黄素联合多西紫杉醇后P53和P21蛋白表达显著增加,说明姜黄素联合多西紫杉醇提高人肺癌细胞的放射敏感性可能和促进P53和P21的表达防止细胞的癌变相关。细胞周期是影响细胞增殖的重要因素之一[9]。本研究结果显示,用姜黄素联合多西紫杉醇处理后的人肺癌细胞G2/M期细胞数目显著增加,说明姜黄素联合多西紫杉醇可以有效将细胞周期阻滞于G2/M期,同时也说明了姜黄素联合多西紫杉醇提高人肺癌细胞的放射敏感性可能和阻滞细胞周期。

姜黄素联合多西紫杉醇对人肺癌细胞放疗增敏其作用机制与肿瘤细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关,且呈浓度依赖性。

参考文献：

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[4]赵嘉惠,张华屏,王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报,2007,38(3):262-263.

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