肺癌是当前全球最常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌治疗取得了较大进展,但死亡率仍高居恶性肿瘤首位[1]。肿瘤细胞具有不断增殖的特性,且肿瘤细胞的增殖需要大量能量。氧化磷酸化是细胞能量代谢的主要途径之一[2],能生成大量三磷酸腺苷(adenosinetriphosphates,ATP),可为肿瘤细胞的持续生长提供能量[3]。因此,抑制肿瘤细胞的能量生成,可有效抑制肿瘤细胞增殖。三磷酸腺苷合酶β亚基(ATP5B)和细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(COXⅣ)是氧化磷酸化能量代谢的两个关键酶,抑制其酶的活性可降低肿瘤细胞的能量代谢速率[4,5]。ATP、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)的浓度可直接反映机体能量代谢水平的高低,线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,MMP)的正常是维持线粒体进行氧化磷酸化的先决条件[6,7]。中医学认为,燥热伤肺是肺癌的重要病机[8]。清燥救肺汤能清热润燥,主治燥热伤肺重症,与肺癌燥热病机相符[9]。合理运用清燥救肺汤不仅可以保护肺功能,减少并发症,还能降低放化疗所致肺损伤的发生率[10],故常用于肺癌中医临床治疗[11,12]。前期研究发现,清燥救肺汤能显著降低Lewis肺癌小鼠的瘤重,抑制其肺癌细胞活性[13],且能减少癌细胞葡萄糖的摄取,显著降低肺癌细胞糖酵解乳酸的形成,抑制糖酵解等能量代谢途径关键限速酶活性[14]。本文在前期研究的基础上,拟建立荷Lewis肺癌小鼠模型,从氧化磷酸化能量代谢角度进一步探讨清燥救肺汤治疗肺癌的作用机制。本实验方案经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准(编号JZLLSC:2017-0030)。

1、材料及方法

1.1动物和瘤株

SPF级C57BL/6J小鼠50只,雄性,体质量(20±2)g,购自常州卡文斯实验动物有限公司,实验动物合格证号SCXK(苏)2016-0003;小鼠Lewis肺癌细胞,编号36470TM,购于ATCC公司。

1.2药物

清燥救肺汤组成:桑叶9g,生石膏12g,阿胶9g,炙甘草3g,枇杷叶9g,党参12g,麦冬10g,苦杏仁9g,购于江西省中医院中药房。环磷酰胺(CTX,批号16092525,规格0.2g/瓶),江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.3主要试剂及仪器

Trizol(批号15596026),ThermoFisher公司;反转录试剂盒(批号RR047A)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)试剂盒(批号RR820A),日本Takara公司;RIPA细胞裂解液(批号C1053),北京普利莱基因技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒(批号CW0014S),北京康为世纪生物科技有限公司;COXⅣ一抗(批号ab202554),美国Abcam公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG二抗(批号ZB-2301)、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗(批号TA-08)、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗(批号ZB-2305),北京中杉金桥有限公司;ATP(批号A2383)、ADP(批号A2754)、AMP(批号A1752)试剂,美国Sigma公司;组织线粒体分离试剂盒(批号C3606)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1,批号C2006),上海碧云天生物技术有限公司。

冷冻离心机(GTR16-2型,北京时代北利离心机有限公司);紫外分光光度计(UV752型,上海佑科仪器仪表有限公司);倒置显微镜(DMI3000B型,德国Leica公司);LongGeneRNA逆转录仪(XW-80A型,上海青浦沪西仪器厂);荧光定量PCR仪(AFD9600型,杭州安杰思有限公司);恒温摇床(TC-100B型,上海领成生物科技有限公司);高效液相色谱仪(E2695-2489型,美国Waters公司);流式细胞仪(NovoCyte型,杭州艾森生物有限公司);超高灵敏度化学发光成像系统(ChemiDocTMXRS+型,上海伯乐生命医学产品有限公司)。

1.4Lewis肺癌细胞培养及造模

Lewis肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养,置于37℃,5%CO2培养箱中培养14d。取生长状态最佳的细胞,用生理盐水调节其密度为5×106个/ml,以每只0.2ml的标准在小鼠右腋下接种[14]。接种7天后,造模小鼠右腋下可触及瘤块,即Lewis肺癌小鼠模型建立成功[15]。

1.5动物分组及给药

50只小鼠按体重采用区组随机法用随机数字表分为模型组,CTX组,清燥救肺汤高、中、低剂量组,每组10只。各组小鼠分别接种Lewis肺癌细胞24h后,模型组以0.2ml生理盐水灌胃,每日2次;CTX组隔日1次以50mg/kg剂量腹腔注射;根据前期研究[14]结果及《中药药理研究方法学》[16]确定清燥救肺汤给药剂量,清燥救肺汤高、中、低剂量组分别以11、5.5、2.75g/(kg·d)剂量灌胃,其中11g/(kg·d)剂量为人与小鼠的等效剂量,每日2次。清燥救肺汤各剂量组在接种前后14天均灌胃,其余各组仅在接种细胞24h后给药14天。接种14天后,处死小鼠取瘤组织,-80℃保存备用。

1.6Real-timePCR法检测肺癌组织中ATP5BmRNA表达

取冰冻肿瘤组织50mg放入研钵中,用液氮将其研磨成粉,加入1mlTrizol重悬,室温振荡裂解后,以4℃、12000r/min(离心半径6.2cm)离心10min沉淀组织细胞碎片和杂质,上清液转移到新的离心管中,加入0.2ml氯仿,用涡旋仪剧烈震荡混匀30s后,室温静置3min后,于4℃、12000r/min(离心半径6.2cm)离心15min,离心后液体会分成3层,上层透明液体含有RNA。将上层透明液体转移到新的离心管中,加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀,室温静置10min使RNA充分析出,于4℃、12000r/min(离心半径6.2cm)离心10min沉淀RNA。小心吸去上清,加入1ml75%乙醇清洗杂质,轻微混匀后,4℃、7500r/min(离心半径6.2cm)离心5min,小心吸去上清,沉淀于室温干燥5min。RNA沉淀用无核酶水溶解,用移液器反复吹打充分溶解提取总RNA,RNA浓度及纯度用微量紫外分光光度计测定。将提取的总RNA按试剂盒说明进行逆转录及Real-timePCR,RT-PCR反应条件为95℃预变性15s,扩增,95℃变性5s,60℃退火15s,2℃延伸30s,共40个循环;95℃15s,60℃1min,95℃15s绘制溶解度曲线。以相对表达量(2-△△Ct)表示目的基因mRNA的表达水平,β-肌动蛋白(β-actin)为内参。引物序列由南昌乐悠生物科技有限公司设计合成,引物序列:β-actin:上游AACAGTCCGCCTAGAAGCAC,下游CGTTGACATCCGTAAAGACC,产物大小198bp;ATP5B:上游GGGATTACCACCCATCCTAAAT,下游TACTTTCTGGCCTCTAACCAAG,产物大小389bp。

1.7Westernblot法检测肺癌组织中COXⅣ蛋白表达

取肺癌组织,充分研磨后加入RIPA细胞裂解液,冰上裂解30min,4℃、12000r/min(离心半径6.2cm)离心15min,提取总蛋白上清液,用BCA法测蛋白浓度,以GAPDH为上样内参对照。将各组蛋白调至等浓度后进行SDS-PAGE电泳,转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭,TBST洗膜3次后,加入一抗(1∶2000),4℃孵育过夜;洗膜,加二抗(1∶2000),显影,曝光。采用AlphaviewSA(3.3.0.0)图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

1.8高效液相色谱法(HPLC)检测肺癌组织中ATP、ADP和AMP含量

Lewis肺癌组织称重,加入0.4mol/L冰预冷的高氯酸(肺癌组织∶高氯酸为1∶5),用超声细胞粉碎机粉碎、匀浆;4℃、10000r/min(离心半径6.2cm)离心10min,取上清液100μl,加入1mol/L碳酸钾与甲醇混合液(体积比4∶1)中和高氯酸50μl,4℃、10000r/min(离心半径6.2cm)离心10min,取上清100μl加水100μl稀释,HPLC检测。色谱柱:PhenomenexLunaC18柱(250mm×4.6mm,5μm);进样量20μl,柱温:室温,样品温度:4℃,检测波长254nm,流动相A磷酸二氢钠溶液,流动相B甲醇。

1.9JC-1法检测肺癌组织MMP

组织线粒体的分离及JC-1染色工作液的配制均按照试剂盒说明书操作。将配置好的JC-1染色工作液用JC-1染色缓冲液(1×)稀释5倍,在稀释后的JC-1染色工作液中加入纯化的线粒体。JC-1单体激发波长490nm,发射波长530nm;JC-1聚合物激发波长525nm,发射波长590nm。在MMP较高时,产生红色荧光,JC-1为聚合物;MMP较低时,产生绿色荧光,JC-1为单体,可以通过荧光颜色的转变来检测MMP变化。采用流式细胞仪分别测定单体和聚合物的值,以聚合物与单体的比值表示MMP水平。

1.10统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析,计量资料用(x¯±s)表示,由于线粒体膜电位数据方差不齐,故采用Kruskal-WallisH检验进行平均秩多重比较,其他数据采用单因素方差分析,用LSD法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组小鼠肺癌组织ATP5BmRNA表达比较

表1示,与模型组比较,CTX组和清燥救肺汤高、中剂量组ATP5BmRNA降低(P<0.05或P<0.01);与CTX组比较,清燥救肺汤高、中、低剂量组ATP5BmRNA升高(P<0.05或P<0.01);与清燥救肺汤高剂量组比较,清燥救肺汤中、低剂量组ATP5BmRNA升高(P<0.05或P<0.01)。

表1各组小鼠肺癌组织ATP5BmRNA、COXⅣ蛋白表达比较

2.2各组小鼠肺癌组织COXⅣ蛋白表达比较

表1、图1示,与模型组比较,CTX组和清燥救肺汤高、中、低剂量组蛋白表达下调(P<0.01);与CTX组比较,清燥救肺汤高、中、低剂量组COXⅣ蛋白表达上调(P<0.01);与清燥救肺汤高剂量组比较,清燥救肺汤中、低剂量组COXⅣ蛋白表达上调(P<0.01);与清燥救肺汤中剂量组相比,清燥救肺汤低剂量组COXⅣ蛋白表达上调(P<0.01)。

2.3各组小鼠肺癌组织ATP含量及ADP/ATP、AMP/ATP值比较

表2示,与模型组比较,CTX组和清燥救肺汤高、中、低剂量组ATP含量显著降低,ADP/ATP值及CTX组,清燥救肺汤高、中剂量组AMP/ATP值显著升高(P<0.05或P<0.01);与CTX组比较,清燥救肺汤中、低剂量组ATP含量,清燥救肺汤高剂量组AMP/ATP值显著升高,清燥救肺汤中、低剂量组AMP/ATP值及清燥救肺汤低剂量组ADP/ATP值显著降低(P<0.05或P<0.01);与清燥救肺汤高剂量组比较,清燥救肺汤中、低剂量组ATP含量显著升高,AMP/ATP、ADP/ATP值显著降低(P<0.05或P<0.01);与清燥救肺汤中剂量组比较,清燥救肺汤低剂量组ATP含量显著升高(P<0.05)。

表2各组小鼠肺癌组织ATP含量、ADP/ATP及AMP/ATP值比较

图1各组小鼠肺癌组织COXⅣ蛋白电泳图

2.4各组小鼠肺癌组织MMP水平比较

表3示,各组MMP的总体水平差异有统计学意义(H=47.06,P<0.001)。其中,与模型组比较,CTX组和清燥救肺汤高、中剂量组MMP明显降低(P<0.05或P<0.01);与CTX组比较,清燥救肺汤中、低剂量组MMP均升高(P<0.05或P<0.01);与清燥救肺汤高剂量组比较,清燥救肺汤低剂量组MMP明显升高(P<0.05)。

表3各组小鼠肺癌组织MMP水平比较

3、讨论

肺癌常有干咳少痰、痰中带血、声音嘶哑等燥热伤肺表现,放化疗后更为明显。中医古文献中无“肺癌”这一病名,但其症状及体征散见于诸多文献,如《素问·奇病论篇》称“息积”,《难经》称“息贲”。从其症状描述来看,更似《金匮要略》所述“肺痿”,症见咳血、吐痰,上气喘满,口干舌燥,形体消瘦,咽喉嘶哑,心烦胸痛,特别是该文提到“重亡津液,故得之”,对肺癌燥热病机研究有重大启示。现代中医学认为,肺为娇脏,喜润恶燥,且肺与外界直接相通,易受邪侵。如长期吸烟、工业废气、汽车尾气、石棉、矿石粉尘、煤焦烟炱、放射性物质等,尤其是肺癌的首要病因吸烟导致热毒灼津,炼液为痰,日久耗伤正气,正不能抗邪,痰瘀胶结于肺,形成积块。因此,诸多医家提出燥热伤肺是肺癌的重要病机[8]。

清燥救肺汤为清代名医喻嘉言治疗燥热伤肺重症代表方,该方重用霜桑叶为君药,清透肺金燥热;臣以生石膏辛甘而寒,清泄肺热,麦冬养阴润肺。君臣相伍,宣中有清,清中有润。党参益气生津,合炙甘草以培土生金;苦杏仁、枇杷叶苦降肺气而止咳;阿胶助麦冬养阴润肺,肺得滋润,则治节有权,共为佐药。炙甘草清热解毒,调和诸药,为使。全方轻宣清透合以凉润,与肺癌燥热病机相符,能较好地缓解燥热伤肺症状。

COXⅣ是线粒体氧化呼吸的关键酶,对线粒体氧化磷酸化具有重要作用,能参与ATP的合成,为细胞各项生命活动提供能量[17],其酶活性的高低直接影响线粒体的结构和功能[18]。本研究实验结果显示,清燥救肺汤各剂量组均能下调COXⅣ蛋白表达水平,从而影响细胞能量代谢,减少为机体供能。

线粒体是由双层膜包被的囊状结构,外膜有较大内部通道,内膜通透性低,但这种不通透性对ATP的生成和MMP的维持起重要作用。MMP是线粒体在氧化呼吸过程中内膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差,膜电位的正常是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的先决条件。MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能,MMP异常导致线粒体膜的功能和状态发生改变,从而影响线粒体进行氧化磷酸化,导致细胞能量代谢异常[19]。本研究结果显示,清燥救肺汤能降低线粒体膜电位。线粒体膜电位降低,则膜电位的电势能降低,若兼有ATP5B活性减弱,则ATP合成减少。

ATP合酶位于线粒体内膜,是能量代谢的关键酶。其利用线粒体内膜两侧质子差形成的势能,通过结合变构机理旋转合成ATP[20],达到高效的能量转化。ATP5B是ATP合酶F1结构域的β亚基,为细胞线粒体能量代谢的重要亚基,能在跨膜质子梯度存在下将ADP转化为ATP[21],亦是氧化磷酸化的关键限速酶。Formentini等[22]研究显示,ATP5B的表达率影响肿瘤的侵袭力。ATP5B表达的高低直接影响ATP合酶的功能,其表达的增加或减少,可调节氧化磷酸化的水平[23]。ATP5B的高表达会促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示,清燥救肺汤中高剂量能下调ATP5BmRNA表达,影响氧化磷酸化水平,导致肿瘤细胞能量代谢途径受阻,ATP生成减少。

ATP是生物机体的能量来源,在细胞代谢活动中占重要地位。研究发现,ATP含量与能量代谢密切相关,ADP/ATP值与AMP/ATP值能反应能量代谢状态[24]。ADP和AMP是ATP的代谢产物,ATP、ADP、AMP的浓度是描述细胞代谢的主要参数,直接反应机体能量代谢水平的高低[6]。线粒体通过氧化磷酸化合成ATP,为细胞内多种化学反应和功能提供能量。本研究结果显示,清燥救肺汤各剂量均能降低ATP的含量,ATP合成减少则机体能量代谢水平减弱,肿瘤细胞获能减少。

综上所述,清燥救肺汤高、中剂量均可不同程度降低COXⅣ蛋白表达、ATP5BmRNA表达、线粒体膜电位及ATP含量,提示清燥救肺汤能降低肿瘤细胞氧化磷酸化能量代谢水平,发挥抗肿瘤细胞增殖的功效,其中清燥救肺汤高剂量疗效更佳。此研究结果将有助于建立靶向氧化磷酸化能量代谢的肺癌治疗新策略,也为后续从升高AMP/ATP值诱导自噬角度进一步探索清燥救肺汤抗肺癌作用研究奠定基础。

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基金:国家自然科学基金(81660729);江西省研究生创新专项(YC2019-S360);江西省自然科学基金(20202BAB206075)