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IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达及临床意义
摘要：目的 探究IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌(HBV-HCC)组织中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法 通过组织芯片免疫组织化学染色方法来检测HBV-HCC患者的癌组织和癌旁组织中B细胞编码κ轻链多肽基因抑制激酶E(IKBKE)的蛋白表达；整理并分析患者的一般资料、临床体征及病理报告结果，检测相关的血液指标；使用Pearson相关性分析比较IKBKE在肝细胞肝癌组织中的表达及其与患者的一般临床资料、临床体征、血液指标、病理结果和预后的相关性。结果 该研究发现，在HBV相关的肝癌患者中，IKBKE的蛋白表达在癌组织中的表达水平显著高于正常组织，高表达组的生存时间明显低于低表达组。此外，IKBKE表达与肝硬化程度呈负相关，与TFF3、pCEA和Ki67等指标呈正相关。结论 IKBKE、TFF3、pCEA和Ki67的联合检测有助于预测HBV相关肝癌的预后。
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肝癌发病率在常见癌症种类中居第六位，是世界上癌症相关死亡的第三大原因[1]。肝癌的病理类型分为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和HCC-ICC混合型(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma ,CHC )。其中最常见的类型是HCC,有85%～90%的肝癌患者为此类型，其五年生存率大约为18%。大多数HCC患者都有慢性肝病病史，由于长期感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)而导致的慢性肝病和酗酒或酒精性脂肪性肝炎(alcoholic Steatohepatitis, ASH),非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)等导致的慢性肝病。HCC的危险因素在全球范围内的流行程度不同，HBV在亚洲占主导地位[2]。目前根据最新共识及实践指南，临床常采用以下流程进行肝细胞肝癌的诊断：HBV或HCV感染，合并肝硬化，肝内结节直径>2 cm, 且腹部彩色超声、超声造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)、计算机断层成像(computed tomography, CT)和磁共振成像(magneticresonance imaging, MRI)四项检查中至少一项影像学检查出现肝脏占位动脉期快速强化而静脉期或延迟期快速洗脱的“快进快出”肝细胞肝癌典型影像学特征，则可诊断为HCC。一项2014年的调查发现，诊断出HCC-HBV的患者预后中位生存期为10.3月[2]。因此，人们一直在寻求改善筛查、诊断和治疗HCC的策略，以改善这种恶性肿瘤的预后。虽然甲胎蛋白(alpha-Fetoprotein, AFP)与早期和晚期HCC-HBV的不良预后有关，但仍然缺乏特异性和敏感性。因此，目前的挑战仍然是开发其他生物标志物以进行早期诊断、选择适合的治疗方法以及预后判断。K轻链多肽基因抑制激酶E(inhibitor of nucleat factor kappa-B kinase subunit epsilon, IKBKE)是由Shimada等于1999年从小鼠的巨噬细胞中首次分离发现的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其主要通过核转录因子κB(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)信号通路在先天免疫调节中发挥重要作用[3]。该通路在各种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。IKBKE在卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤中过表达[4,5,6],它促进肿瘤的发生、发展，且其表达与肿瘤的分化和分期等相关，但在HBV-HCC中尚缺乏相关研究报道。因此，本研究拟通过组织芯片免疫组织化学染色方法来检测HBV-HCC癌组织和癌旁组织的IKBKE蛋白表达情况，并通过与患者的一般临床资料、临床体征、血液指标、病理结果和预后进行相关性分析，为IKBKE对HBV-HCC发生、发展和预后判断提供参考。
1、材料与方法
1.1 一般资料
组织芯片购自于上海卓灏医药科技有限公司。共纳入HBV-HCC患者72例，其中，男性患者67例，女性患者5例。本研究方案获得了本院医学伦理委员会批准。
1.2 临床检测及愈后指标
生化指标包括乙肝表面抗原(HBsAg)、AFP、糖类抗原199(CA199)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、凝血酶原时间(PT)。病理检测包括最大肿瘤直径、有无门脉癌栓、包膜是否完整、有无镜下癌栓。免疫组化指标包括肝细胞抗原(hepatocyte paraffin 1, Hep-Par 1)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18, CK18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)、分化簇34(cluster of differentiation 34, CD34)、三叶因子-3(trefoil factor 3, TFF3)、多克隆性癌胚抗原(polyclonal carcinoembryonic antigen, pCEA)、水通道蛋白1(aquaporin 1, AQP-1)、附膜蛋白(mucin 1, MUC-1)、β连环蛋白(β-catenin)、细胞核增殖抗原(Antigen KI67, Ki67)、E钙粘附蛋白(E-cadherin, E-cad)、分化簇10(cluster of differentiation 10, CD10)、唾液酸糖蛋白(podoplanin, D2-40)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3 GLy3),同时统计术后复发、转移及生存时间。
1.3 免疫组化
按免疫组织化学染色试剂盒实验步骤操作，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，用专有试剂(cell conditionner 1,Ventana Medical Systems)进行抗原修复，修复时间为60 min, IKBKE 抗体(1∶1 000 稀释) 孵育，二氨基联苯氨( DAB) 显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片固定。使用双人双盲法对免疫组化染色切片进行结果判定。IKBKE的表达通过计数并分析每张切片中阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱来计算免疫组化染色的评分。①阳性细胞百分比，每张切片随机选取5个400×镜下视野，随机计数该镜下的100个肿瘤细胞来计算其中阳性细胞占总细胞的百分比。IKBKE主要存在于细胞质中，所以只有当细胞质或细胞核呈现淡黄色、褐色或棕褐色状态时，才能判定IKBKE蛋白表达阳性，该细胞为阳性细胞。其中1分为阳性细胞百分比< 33%,2分为阳性细胞百分比为34%～66%,3分为阳性细胞百分比≥ 67%。②染色强度，1分为无色或淡黄色，2分为褐色，3分为棕褐色[7]。按照以下公式计算免疫组化染色评分：得分(1)×得分(2)=免疫组化染色评分。其中，免疫组化染色评分1～3分为IKBKE低表达组，大于3分为IKBKE高表达组。
1.4 统计学方法
定量资料以表示，定性资料以频数表示。使用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。在方差齐性检验后行独立样本t检验，比较肝癌组织和癌旁正常组织中IKBKE蛋白表达，免疫组化染色评分与研究对象的一般临床资料、临床体征、血液指标、术后生存时间等行Pearson相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。使用Kaplan-Meier曲线来计算无瘤生存时间和整体生存时间，并采用对数秩(Log-rank)检验生存分析。使用GraphPad Prism 7.0绘制统计图。
2、结果
2.1 IKBKE在HCC中的表达
如图1所示，HBV-HCC患者的癌组织中IKBKE蛋白的表达显著高于癌旁组织，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
图1 HBV-HCC患者的癌组织和癌旁组织中IKBKE蛋白表达比较 下载原图
采用免疫组织化学染色方法检测肝细胞肝癌患者癌组织中IKBKE的表达水平(n=72)。如图2所示，肉眼观察可发现大多数研究对象的癌组织中IKBKE表达呈阳性，少数呈阴性，免疫组化评分(5.49±2.51)。图2B、C均显示出肿瘤细胞染色强度深，呈明显褐色，甚至是棕褐色，阳性细胞数多，视野中阳性细胞比例高于55%,即IKBKE在癌组织中高表达。
图2 HBV-HCC患者癌组织IKBKE表达免疫组织化学染色图
采用免疫组织化学染色方法检测HBV-HCC患者癌旁组织中IKBKE的表达水平，免疫组化评分(2.81±1.38)。图3均显示出肿瘤细胞染色强度浅，呈无色或淡黄色，阳性细胞数较少，视野中阳性细胞比例显著低于25%,即IKBKE在癌旁组织中低表达。
图3 HBV-HCC癌旁组织IKBKE表达免疫组织化学染色图
2.2 HBV-HCC患者的生存曲线
根据HBV-HCC癌组织中IKBKE的表达水平，将所有符合标准的研究对象分为IKBKE高表达组和IKBKE低表达组，其中高表达组41例，低表达组23例。如图4A所示，IKBKE高表达组的无瘤生存时间显著低于IKBKE低表达组，且差异具有统计学意义(P=0.04)。如图4B所示，IKBKE高表达组的整体生存时间显著低于IKBKE低表达组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
图4 HBV-HCC患者的无瘤生存曲线和整体生存曲线
2.3 IKBKE表达与腹水、肝硬化的相关性
如表1所示，通过对HBV-HCC患者癌组织中IKBKE表达与患者临床体征使用Pearson相关性分析发现，癌组织中IKBKE表达与肝硬化呈显著负相关(r=-0.26),且差异具有统计学意义(P<0.05)。虽然癌组织IKBEKE表达与腹水呈正相关趋势(r=0.03),但癌组织中IKBKE表达与腹水不存在相关性(P>0.05)。综上所述，HBV-HCC患者癌组织中IKBKE表达与肝硬化呈显著负相关(r=-0.26),且差异具有统计学意义(P<0.05)。
表1 HBV-HCC患者癌组织IKBKE表达与临床体征的相关性
2.4 IKBKE表达与生化指标的相关性
如表2示，HBV-HCC癌组织中IKBKE表达与血清AFP、CA199、TB、DB、ALB、ALT、AST、PT和HBsAg水平均不存在相关性。
表2 HBV-HCC患者癌组织IKBKE表达与生化指标的相关性
2.5 IKBKE表达与病理结果的相关性
如表3示，HBV-HCC患者癌组织中IKBKE表达与病理结果中免疫组化的TFF3、pCEA和Ki67呈显著正相关(r=0.25,r=0.32,r=0.28),且差异具有统计学意义(P=0.028,P=0.005,P=0.015)。癌组织中IKBKE表达与最大肿瘤直径、有无门脉癌栓、包膜是否完整、有无镜下癌栓、Hep-Par 1、CK18、CK19、CD34、AQP-1、MUC-1、B-catenin、E-cad、CD10、D2-40和GLy3均不存在显著相关性。
3、讨论
亚洲HCC发病率最高，世界上72.5%的HCC发生在亚洲，仅中国就占了全世界病例的近一半[1]。在中国，慢性HBV感染率为18%,它是导致HCC的主要因素[8]。HCC预后极差，然而其早期诊断存在困难，因为目前可用的生物标志物缺乏特异性和敏感性。因此，正在寻找其他生物标志物来改善肝癌的筛查和早期诊断。IKBKE是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在先天免疫调节中发挥重要作用，同时在多种恶性肿瘤中异常表达，如卵巢癌、乳腺癌和胶质瘤等[4,5,6]。IKBKE可在肿瘤细胞中直接磷酸化p65的ser536位点，进而激活NF-κB信号通路[9]。同时，IKBKE可在肿瘤细胞中磷酸化AKT的ser473位点，激活AKT信号通路，进而在肿瘤的恶性进展中发挥重要作用[10]。 HCC癌旁组织中IKBKE和p-IKBKE蛋白表达较低，癌组织中IKBKE和p-IKBKE蛋白表达较高，并且与肿瘤分化程度、临床分期和有无转移均显著相关[7]。另一研究发现，miR-4458能够靶向IKBKE,并抑制肝癌细胞活力[11]。这些研究提示，IKBKE与HCC的关系十分密切，然而IKBKE与HBV-HCC的关系尚未有研究揭示，也无文献表明IKBKE与乙肝之间有联系。本研究发现，HBV-HCC癌组织中IKBKE的表达显著高于癌旁正常组织，这与之前的研究结果相一致。
表3 HBV-HCC患者癌组织IKBKE表达与病理结果的相关性
中国HCC的高危因素包括HBV/HCV感染、非酒精性脂肪肝、饮食中接触黄曲霉毒素B1、长期过度饮酒、各种原因导致的肝硬化、存在肝癌家族史等。其中，HCC发生的主要危险因素为肝硬化。研究表明，全球54%的肝细胞肝癌是由于HBV感染而引发的肝硬化所导致[12]。
三叶因子3 (Trefoil factor 3,TFF3) 是三叶因子家族成员之一，可抑制上皮细胞的凋亡，促进上皮细胞的迁移，进而帮助修复受损黏膜[13]。尚允利[14]研究发现，肝细胞肝癌组织中TFF3的阳性表达率为62.1%,其显著高于癌旁正常组织中的表达(33.8%),且癌组织中TFF3的表达与肿瘤的直径和TNM分期呈负相关。而杨凯等[15]研究发现，肝细胞肝癌患者的癌组织中TFF3表达显著升高，且血清TFF3水平也显著升高。以上研究提示TFF3是肝癌潜在标志物，但是尚无文献表明TFF3与乙肝两者之间有联系。除了TFF3,pCEA也被证明是HCC的敏感标志物。pCEA对HCC的灵敏度为71%,在癌组织中阳性率为72%[16,17]。Ki67是一种细胞增殖标志物，在细胞周期G1、S、G2、M期表达，而在G0期不表达，临床常用其作为肿瘤预后指标[18]。本研究发现，癌组织中IKBKE表达与病理结果中免疫组化的TFF3、pCEA和Ki67呈显著正相关，且差异具有统计学意义(P<0.05),进一步证实了在临床工作中IKBKE可与TFF3、pCEA和Ki67联合检测，辅助诊断肝细胞肝癌。
IKBKE是多种肿瘤的致癌基因，其可通过多种方式激活NF-κB信号通路，也可通过募集各类支架分子来进行干扰素信号转导，影响癌症患者的预后。Orlova等[5]对IKBKE过表达的乳腺癌细胞进行RNA测序分析发现，IKBKE与乳腺癌的增殖、侵袭和转移具有高度相关性。本研究发现，HBV-HCC患者癌组织中IKBKE表达与肝硬化呈显著负相关。IKBKE高表达组的DFS和OS均显著低于IKBKE低表达组(P<0.05)。这表明，IKBKE在HBV-HCC患者癌组织中的表达可影响患者的生存预后。
综上所述，IKBKE与HBV-HCC患者的肝硬化程度、DFS、OS关系密切，IKBKE在HBV-HCC中的表达与患者的肝硬化、DFS和OS呈负相关，与患者癌组织中的TFF3、pCEA和Ki67的表达呈正相关。
参考文献:
[7]葛倩文,陈忆嘉,严晓璐,等.IKKε､p-IKKε在肝癌组织中的表达及意义[J].中国临床研究,2017,30(5):577-581.
[14]尚允利.TFF1和TFF3在肝细胞癌中的表达及临床意义[D].合肥:安徽医科大学,2014.
[15]杨凯.TFF3在不同分期肝硬化及HCC患者血清和组织中的表达及临床意义[D].长沙:中南大学,2013.
[16]陈旭东,何松,陈亚丽,等.HepPar-1等免疫标记在肝癌鉴别诊断中的价值[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(8):847-852.
文章来源:刘大成,阮圆.IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达及临床意义[J].滨州医学院学报,2024,47(02):117-121.
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肝癌属于消化道类恶性肿瘤，根据其发病类型分为原发性及继发性，我国是肝癌发病大国，我国肝癌发病率占世界肝癌发病率的半数[1],是临床高发性恶性肿瘤。并且由于早期肝癌无特异性临床症状，当癌症发展至中晚期才表现出明显症状，大多数肝癌患者确诊时病程已十分严重，基本无法采取手术治疗且癌细胞转移能力较强，进一步导致该病的致死率极高[2,3],是治愈难度较高的一种癌症。
2024-04-27
程序性死亡配体-1(PD-L1)是一种重要的免疫检查点蛋白，它与T细胞上的程序性死亡受体-1(PD-1)接触后会激活共同抑制信号，从而抑制效应T细胞[3]。PD-1/PD-L1轴的生理作用是维持外周耐受与自身免疫之间的平衡，但癌细胞会劫持这一过程，以逃避宿主免疫监视[4]。癌细胞通过表达PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，诱导免疫抑制，从而使肿瘤细胞能在机体内避免T细胞的杀伤[5]。
2024-04-26
原发性肝癌主要由肝细胞癌（75%～85%）和肝内胆管细胞癌（10%～15%）组成，在全球常见癌症中位列第六且为全球癌症死亡的第三大原因，2020年约有90.6万新发病例和83万死亡病例，且最高的发病率往往出现在发展中国家[1]。肝癌的危险因素主要包括HBV或HCV感染、食用黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、吸烟、超重和糖尿病[2]，在许多地区虽然HBV和HCV的流行率已得到控制，但代谢性因素造成的肝癌相关负担将变得越来越严重[3,4]。
2024-04-24
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。寻找能改进筛查、诊断和治疗策略的可靠生物标志物，对于改善HCC患者的预后至关重要。DNA损伤是肿瘤进展的一个重要因素，不适当的DNA修复可导致细胞恶性转化[3,4]。瓣状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1）是一种结构特异性多功能酶，在DNA复制和修复中发挥着关键作用，且与癌症的发展有关[5,6,7,8]。
2024-04-22
MDSCs是一类未成熟、异质性的细胞群，包括髓系前体细胞、不成熟的粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell,DC）等[1]。当机体患有肿瘤时，MDSCs可以积聚在荷瘤动物的骨髓、脾脏、肿瘤组织、外周血中以及肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中[2,3,4]。近年来，人们发现肝脏也是MDSCs扩增和归巢的器官，并且只要小鼠处于荷瘤状态，即使肝脏没有肿瘤存在，肝脏MDSCs数量仍会增多[2,3]。
2024-04-22
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第四大原因[1]。据估计，2018年约有841 000例HCC新发病例，导致782 000人死亡[2]。HCC较高的发生率和死亡率给医疗系统和患者及其家庭带来了沉重的社会经济负担，成为重大的社会健康问题。
2024-04-22
过去认为伪基因是无功能的基因组化石，随着生物信息学发展，近年发现伪基因广泛参与细胞分化、炎症和凋亡等重要生命活动[1]。研究发现伪基因在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤发生发展中起重要作用，尤其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移中扮演重要角色[2,3,4]。HCC在全球范围内严重威胁人类健康，预后差，尚无有效治疗方法。
2024-04-22
肝癌是世界上癌症相关发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，尽管目前有许多化疗方法可用于肝癌的治疗，但其在发挥抗肿瘤作用同时会对机体产生一定的毒性作用[1]。迷迭香酸是一种天然多酚类化合物，是迷迭香、肿节风等中药的有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种药理学活性[2]。
2024-04-18
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占所有病例的90%，其发病率呈上升趋势[1]。近年来，虽然HCC治疗方面的研究取得了重大进展，但其预后仍然不乐观。肝切除术和肝移植被认为是HCC患者获得长期生存的重要手段，但只有10%的患者符合切除条件。
2024-04-14
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是临床常见的恶性肿瘤，多数HCC发现时已经进入中晚期，丧失了手术的机会[1,2]。门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus, PVTT)指HCC发生门脉血管浸润，在HCC患者中其发生率约44%～62.2%[3]。巴塞罗那指南中，PVTT的主要推荐是靶向治疗，但肝切除术和经动脉化疗栓塞化疗术(transarterial chemoembolization, TACE)仍是重要的治疗方案[4,5]。
2024-04-09
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期刊名称：肝癌电子杂志
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主管单位：国家卫生和计划生育委员会
主办单位：人民卫生出版社
出版地方：北京
专业分类：医学
国际刊号：2095-7815
国内刊号：11-9351/R
创刊时间：2014年
发行周期：季刊
期刊开本：16开
见刊时间：10-12个月
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2024-03-01
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