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MED8表达与肝癌临床病理特征及其预后的相关性分析
摘要：目的 检测中介体复合物亚基8(mediator complex subunit 8,MED8)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达情况，探讨MED8对HCC的诊断、预后价值及其调控HCC的可能机制。方法 从TCGA数据库下载HCC RNAseq数据以及临床数据，比较HCC癌旁组织和癌组织中MED8的表达差异；Western blot检测肝癌细胞HepG2及正常肝细胞QSG-7701中MED8的表达情况；通过DESeq2包和clusterProfiler包对含有MED8高、低表达组的数据进行表达差异分析及gene ontology(GO)富集分析；免疫组化检测补体经典途径相关蛋白C1qc的表达情况及其与MED8的关系。生存曲线、ROC曲线分析MED8表达与肝癌临床病理特征的相关性与预后价值。结果 MED8在HCC癌组织及肝癌细胞中呈高表达。富集分析显示与MED8相互作用的蛋白主要参与补体的激活和离子反应等生物过程；而补体经典途径相关蛋白C1qc在肝癌组织中上调且与MED8表达呈正相关。临床相关性分析显示：MED8高表达与HCCT分期、病理分期、组织学分级密切相关；生存曲线结果显示：HCC高表达MED8患者总生存率及疾病相关存活率低；ROC曲线结果标明MED8的曲线下面积为0.817,提示MED8可能作为HCC潜在的诊断分子标志物。结论 MED8与肝癌患者的临床分期及预后密切相关，其可能通过补体激活途径影响患者预后。
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上第六大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因[1]。肝癌的分子机制还不完全清楚。由于缺乏有效的早期诊断和靶向治疗，5年生存率仅为11%[2]。主流的检测方法包括计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和糖蛋白生物标志物(如甲胎蛋白)[3]。然而，这些方法有各种限制：CT和MRI昂贵且难以广泛应用，而糖蛋白生物标记物因缺乏对肿瘤区域特异性而受到限制。鉴于早期肿瘤检测可显著提高HCC患者生存率，探索新的标志物非常重要。
Mediator是一种进化上保守的多蛋白复合物，在人类中由33个亚基组成，是转录过程中不可或缺的调节因子[4]。研究表明，某些Mediator亚家族成员的表达在肿瘤中发生了较显著的变化，例如中介体复合物亚基8(mediator complex subunit 8,MED8)在结直肠癌细胞系中发生突变[5];此外，MED8在肾透明细胞癌中的表达与存活时间短、TNM分期相关，且MED8在转移性肿瘤中的表达高于原发肿瘤[6]。然而，MED8与HCC之间的相关性尚未得到评估。
本研究基于TCGA数据分析了MED8在HCC中的表达及预后价值。我们证实，在HCC样本中，MED8表达升高，并与较差的总生存率相关，我们的研究为HCC提供了一种新的诊断和预后指标。
1、材料与方法
1.1 MED8在泛癌及HCC中的表达差异验证
利用UCSC XENA下载经Toil流程统一处理的TCGA和GTEx的TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq数据，Wilcoxon rank sum test法比较MED8在GTEx联合TCGA的癌旁组织样本和TCGA对应的肿瘤样本中的表达情况。同时，从TCGA数据库 下载HCC项目中level 3 HTSeq-FPKM(Fregments Per Kilobase per Million)格式的RNAseq数据以及临床数据。将FPKM格式的RNAseq数据转换成TPM格式后进行HCC癌旁组织及其配对的癌组织样本间的表达比较。
1.2 Western blot验证MED8在正常肝细胞QSG-7701及肝癌细胞HepG2中的表达差异
将QSG-7701及HepG2分别接种于10 cm含牛血清的培养基中培养48 h, RIPA裂解后提取总蛋白并检测蛋白浓度，经过电泳、转膜，兔抗人MED8抗体(购买于Invitrogen Ebioscienc公司)孵育及二抗孵育后，以GAPDH为内参比较MED8在两种细胞中的表达情况。
1.3 MED8在HCC中的共表达分析、可视化显示及共表达基因的富集分析
按照MED8表达量的中位值将HCC患者分为高表达组和低表达组，通过DESeq2包对HTSeq-Counts数据分析表达差异基因，火山图用于展示差异分析的结果(参数设置如下：|logFC|>2,padj<0.05)。clusterProfiler包用于分析基因的本体论(gene ontology, GO)富集分析，包括生物过程(biological process, BP),细胞组分(cellular components, CC)和分子功能(molecular function, MF)),以及京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析。
1.4 HCC患者样本MED8和C1qc蛋白表达水平
通过Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)分析HCC组织和正常肝组织中MED8和C1qc蛋白表达水平，以免疫组化结果进行呈现。
1.5 MED8与HCC临床病理的相关性及预后分析
通过Kruskal-Wallis rank sum test统计方法分别比较MED8表达与HCCT分期、病理分期、组织学分级的关系。按照MED8表达值的中位数，将LIHC数据分为MED8高表达组及低表达组，利用survminer包绘制Kaplan-Meier 图，用于评估MED8对HCC总生存期(overall survival, OS)及疾病相关生存率(Disease-Specific Survival)的预测价值；同时对MED8进行亚组分析，比较在HCCT分期的T1&T2&T3&T4亚群、病理分期的Stage I&Stage II&Stage III&Stage IV亚群、组织学分级G1&G2&G3&G4亚群中MED8对其OS的预测价值。最后通过ROC曲线，分析MED8对HCC的诊断效能。ROC曲线横坐标为假阳性率(false positive rate, FPR),纵坐标为真阳性率(true positive rate, TPR)。
1.6 统计学方法
应用R语言对数据进行分析处理，各数据的比较采用Wilcoxon signed rank test或Kruskal-Wallis rank sum test, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 MED8在16种肿瘤组织中差异表达
Wilcoxon rank sum test法，比较MED8在GTEx联合TCGA的正常样本和TCGA对应的肿瘤样本中的表达情况。结果显示，与正常样本相比，MED8在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(GBM)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宫内膜癌(UCEC)组织中呈高表达，在肾嫌色细胞癌(KICH)和甲状腺癌(THCA)组织中呈低表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.2 MED8在HCC组织中的表达情况
Wilcoxon signed rank test法比较50例HCC样本以及配对的HCC癌旁样本中的MED8的表达情况。结果发现，MED8在HCC样本中呈高表达，差异具有统计学意义(P<0.001,图1A)。进一步实验验证结果表明，与正常肝细胞QSG-7701相比，MED8在肝癌细胞HepG2中呈高表达(图1B)。免疫组化实验也表明，与正常人肝组织相比，MED8在肝癌组织中呈高表达(图1C)。
图1 MED8表达水平
2.3 MED8在HCC中的共表达及富集分析
根据MED8在HCC中表达情况，以中位数为截点将患者分成高表达组和低表达组。差异分析结果显示，两组共有582个差异表达基因，其中536个基因显著上调，46个基因显著下调(图2A)。GO富集分析及KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要参与补体的激活，离子反应等生物过程，如图2B所示。免疫组化实验表明，补体激活明星分子C1qc蛋白表达水平在HCC 标本中升高(图2C)。GEPIA数据库分析显示，在肝癌中，MED8与C1qc的表达呈正相关(R=0.47,P<0.001,见图2D)。
2.4 MED8表达与HCC肿瘤分期、病理分期及组织学分级的关系
MED8表达与TCGA肝细胞肝癌的T分期(图3A)、病理分期(图3B)、组织学分型(图3C)呈显著正相关。
2.5 MED8表达对HCC患者OS及疾病相关存活率的预测价值
以MED8表达值的中位数为截点，将HCC患者分为高表达组和低表达组。KM曲线结果显示：MED8高表达患者OS短[HR=2.49(1.74～3.58),P<0.001,图4A]及疾病相关存活率低[HR=2.57(1.62～4.07),P<0.001,图4B]。
2.6 MED8的亚组预后分析
对HCC的T分期、病理分期、组织学分级进行亚组分析，结果显示：高表达MED8与T分期的T1&T2&T3&T4亚群[HR=2.46(1.72～3.54),P<0.001,图4C]、病理分期的Stage Ⅰ&Stage Ⅱ&Stage Ⅲ&Stage Ⅳ亚群[HR=2.47(1.69～3.62),P<0.001,图4D]、组织学分级的G1&G2&G3&G4亚群[HR=2.49(1.73～3.60),P<0.001,图5E]呈显著相关性。
2.7 ROC曲线评价MED8在HCC中的诊断价值
ROC分析结果显示：曲线下面积为0.817(95%CI 0.778～0.857),提示MED8对肝癌有一定的诊断准确性(图5)。
3、讨论
介体复合物是基因转录的关键调节因子。Mediator分为四个不同的子模块：头、中、尾和激酶[7]。MED的头部和中间模块可以直接与RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,POLⅡ)相互作用，作为转录因子和上游调控元件结合机制之间的桥梁。MED8、MED18和MED20表示中介头域的子模块。MED头模块主要由SRB编码的蛋白质组成[8]。研究表明，MED19[9],MED15[10],MED23[11]在HCC中升高，且与HCC预后相关。但很少有研究评估MED8和癌症之间的关系。MED8被认为是一种多结构域蛋白，由一个n端螺旋结构域、一个灵活的配体和一个与Med18(25)16相互作用的c端螺旋结构域组成。MED8在所有真核生物的转录中起着重要的作用，其功能和/或组成的改变可能会产生重要的功能后果，导致包括癌症在内的各种疾病。免疫组化检测到MED8在肾透明细胞癌中表达高水平，沉默MED8会降低肾透明细胞癌细胞的增殖和运动能力。其他研究表明，MED8在结肠癌中会发生突变[5,12,13]。然而，MED8表达与HCC发生和预后的关系尚未见报道。
图2 MED8高表达组与低表达组中差异表达基因及富集分析
图3 MED8与HCC患者肿瘤分级及分期的相关性分析
为了明确MED8在HCC中的作用，我们分析了来自TCGA的完整临床信息的371例HCC患者的数据。结果表明，HCC组织中MED8表达水平高于正常组织。此外，MED8高表达与T分期、病理分期、组织学分级等病理参数密切相关，提示MED8高表达参与了HCC的侵袭转移。结合MED8高表达组HCC患者总生存率低于MED8低表达组，提示MED8可能作为HCC新的诊断和预后标志物。本文根据MED8在HCC中表达的中位数将其分为高表达组和低表达组，并进行差异分析及GO分析。结果显示，与MED8共表达的基因主要参与补体激活，细胞对铜离子反应等生物过程。补体激活是先天免疫的组成部分，能够抵御入侵病原体。肝脏是合成补体成分的主要来源(>80%),并表达多种补体受体。HCC与先天性及适应性免疫失调密切相关，而免疫网络的核心是补体级联，这是肝脏固有的基本防御系统[14]。研究表明，肿瘤微环境中的补体激活增强了肿瘤生长并增加了转移，可以帮助肿瘤逃避免疫消除[15,16]。HCC是一种以慢性炎症、纤维化和肝硬化为特征的免疫原性癌症。由于HCC几乎仅在慢性炎症环境中出现[17],因此过早的补体激活可能是肿瘤炎症过程的潜在驱动因素。因而，我们猜测MED8通过调控补体激活通路从而影响HCC患者预后。免疫组化分析结果表明，补体激活经典通路分子C1qc在肝癌患者癌组织升高，这与Lee等[18]的报道一致。同时，MED8与C1qc表达水平正相关性。这些结果表明，MED8可能通过上调C1qc水平调控HCC进展。在后续实验中，我们将通过细胞实验和动物学实验验证MED8通过C1qc调控HCC进展的分子机制。
图4 HCC患者中MED8表达水平与其生存及预后的分析
图5 ROC曲线
综上所述，MED8高表达与HCC的T分期、病理分期、组织学分级等病理参数密切相关，MED8可能是HCC诊断和预后的有效生物标志物。同时，我们对MED8调控HCC的分子机制进行了初步研究，从而为开发HCC抗癌药物提供了新的思路。
文章来源:吴爽,张涛元,李俏等.MED8表达与肝癌临床病理特征及其预后的相关性分析[J].实用癌症杂志,2024,39(03):411-416.
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肝癌属于消化道类恶性肿瘤，根据其发病类型分为原发性及继发性，我国是肝癌发病大国，我国肝癌发病率占世界肝癌发病率的半数[1],是临床高发性恶性肿瘤。并且由于早期肝癌无特异性临床症状，当癌症发展至中晚期才表现出明显症状，大多数肝癌患者确诊时病程已十分严重，基本无法采取手术治疗且癌细胞转移能力较强，进一步导致该病的致死率极高[2,3],是治愈难度较高的一种癌症。
2024-04-27
程序性死亡配体-1(PD-L1)是一种重要的免疫检查点蛋白，它与T细胞上的程序性死亡受体-1(PD-1)接触后会激活共同抑制信号，从而抑制效应T细胞[3]。PD-1/PD-L1轴的生理作用是维持外周耐受与自身免疫之间的平衡，但癌细胞会劫持这一过程，以逃避宿主免疫监视[4]。癌细胞通过表达PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，诱导免疫抑制，从而使肿瘤细胞能在机体内避免T细胞的杀伤[5]。
2024-04-26
原发性肝癌主要由肝细胞癌（75%～85%）和肝内胆管细胞癌（10%～15%）组成，在全球常见癌症中位列第六且为全球癌症死亡的第三大原因，2020年约有90.6万新发病例和83万死亡病例，且最高的发病率往往出现在发展中国家[1]。肝癌的危险因素主要包括HBV或HCV感染、食用黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、吸烟、超重和糖尿病[2]，在许多地区虽然HBV和HCV的流行率已得到控制，但代谢性因素造成的肝癌相关负担将变得越来越严重[3,4]。
2024-04-24
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。寻找能改进筛查、诊断和治疗策略的可靠生物标志物，对于改善HCC患者的预后至关重要。DNA损伤是肿瘤进展的一个重要因素，不适当的DNA修复可导致细胞恶性转化[3,4]。瓣状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1）是一种结构特异性多功能酶，在DNA复制和修复中发挥着关键作用，且与癌症的发展有关[5,6,7,8]。
2024-04-22
MDSCs是一类未成熟、异质性的细胞群，包括髓系前体细胞、不成熟的粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell,DC）等[1]。当机体患有肿瘤时，MDSCs可以积聚在荷瘤动物的骨髓、脾脏、肿瘤组织、外周血中以及肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中[2,3,4]。近年来，人们发现肝脏也是MDSCs扩增和归巢的器官，并且只要小鼠处于荷瘤状态，即使肝脏没有肿瘤存在，肝脏MDSCs数量仍会增多[2,3]。
2024-04-22
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第四大原因[1]。据估计，2018年约有841 000例HCC新发病例，导致782 000人死亡[2]。HCC较高的发生率和死亡率给医疗系统和患者及其家庭带来了沉重的社会经济负担，成为重大的社会健康问题。
2024-04-22
过去认为伪基因是无功能的基因组化石，随着生物信息学发展，近年发现伪基因广泛参与细胞分化、炎症和凋亡等重要生命活动[1]。研究发现伪基因在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤发生发展中起重要作用，尤其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移中扮演重要角色[2,3,4]。HCC在全球范围内严重威胁人类健康，预后差，尚无有效治疗方法。
2024-04-22
肝癌是世界上癌症相关发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，尽管目前有许多化疗方法可用于肝癌的治疗，但其在发挥抗肿瘤作用同时会对机体产生一定的毒性作用[1]。迷迭香酸是一种天然多酚类化合物，是迷迭香、肿节风等中药的有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种药理学活性[2]。
2024-04-18
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占所有病例的90%，其发病率呈上升趋势[1]。近年来，虽然HCC治疗方面的研究取得了重大进展，但其预后仍然不乐观。肝切除术和肝移植被认为是HCC患者获得长期生存的重要手段，但只有10%的患者符合切除条件。
2024-04-14
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是临床常见的恶性肿瘤，多数HCC发现时已经进入中晚期，丧失了手术的机会[1,2]。门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus, PVTT)指HCC发生门脉血管浸润，在HCC患者中其发生率约44%～62.2%[3]。巴塞罗那指南中，PVTT的主要推荐是靶向治疗，但肝切除术和经动脉化疗栓塞化疗术(transarterial chemoembolization, TACE)仍是重要的治疗方案[4,5]。
2024-04-09
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期刊名称：肝癌电子杂志
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主管单位：国家卫生和计划生育委员会
主办单位：人民卫生出版社
出版地方：北京
专业分类：医学
国际刊号：2095-7815
国内刊号：11-9351/R
创刊时间：2014年
发行周期：季刊
期刊开本：16开
见刊时间：10-12个月
影响因子：1.474
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2024-03-14
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