首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 外科论文 > 肝胆胰外科论文 > 脂肪因子Vaspin在非酒精性脂肪性肝病中的表达

脂肪因子Vaspin在非酒精性脂肪性肝病中的表达

2021-03-20 103 上传者：管理员

摘要：目的初步探索Vaspin在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）肝脏组织中的表达及其临床意义。方法回顾分析2016年10月—2019年10月首都医科大学附属北京地坛医院收治的78例NAFLD超声引导下肝脏组织细针穿刺患者临床病理资料。采用HE染色和网织Gomori银染色观察肝脏组织的炎症程度和纤维化程度；免疫组织化学染色法检测Vaspin和转化生长因子-β（TGF-β）的表达；分析肝脏组织Vaspin、TGF-β的表达与肝脏组织炎症程度、纤维化程度、血清总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、空腹血浆葡萄糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）的相关性；采用Logistic回归模型分析NAFLD的影响因素。结果Vaspin表达分级与TG呈负相关（rs=-0.279,P<0.05），与LDL-C、FPG呈正相关（rs=0.352和0.312，均P<0.05）。TGF-β表达分级与ALP呈负相关（rs=-0.225,P<0.05）。Logistic回归分析显示，Vaspin表达分级[=2.987(95%CI:1.065,8.379)]、ALT[=1.062(95%CI:1.014,1.112)]、TBIL[=1.502(95%CI:1.147,1.967)]、FPG[=13.111(95%CI:1.430,120.195)]是发生NAFLD的独立危险因素。结论肝脏组织Vaspin高表达提示NAFLD患者病情较重。

关键词：
Vaspin
肝病
脂肪因子类
脂肪肝
加入收藏

我国肝脏疾病中非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）患病率仅次于病毒性肝炎，已成为第一大慢性疾病及肝功异常的首要原因，且患病年龄逐渐年轻化，严重威胁人们的身体健康[1]。在NAFLD发生机制中，脂肪组织特别是内脏脂肪组织有着重要作用[2]。NAFLD患者血清内脏脂肪组织来源的Vaspin水平明显升高，是机体针对胰岛素抵抗的一种代偿机制，也可以抑制促炎脂肪因子抗胰岛素蛋白、瘦素和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）的表达[3,4]。目前，Vaspin是缓解肥胖、降低胰岛素抵抗的新靶点，其研究多集中在肥胖人群、2型糖尿病人群血清学和高脂饮食诱导的动物模型[5,6,7]。鉴于脂肪因子主要通过胰岛素抵抗、肝脂肪变性、肝炎症及肝纤维化4个方面来参与NAFLD的病程进展[8]，本研究初步探索Vaspin在NAFLD不同病理分级肝脏中的表达及其临床意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

回顾分析2016年10月—2019年10月首都医科大学附属北京地坛医院收治的78例NAFLD患者临床病理资料。其中，男性41例，年龄（38±13）岁；女性37例，年龄（48±12）岁。患者均进行超声引导下肝脏组织细针穿刺手术，并对肝脏标本进行病理分析。其中，脂肪肝患者52例（脂肪肝组），非脂肪肝患者26例（非脂肪肝组）。

1.2主要仪器及试剂

多功能自动染色机ST5050（德国Leica公司）。Gomori网状纤维染色试剂盒（上海国药集团化学试剂有限公司），免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），山羊血清一抗Vaspin（英国Abcam公司，ab238745），转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）（英国Abcam公司，ab66043），二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6000D）。

1.3方法

1.2.1HE染色

将NAFLD患者的肝脏组织蜡块连续切片6张，每张切片厚4μm。取其中一张切片采用多功能自动染色机进行HE染色。操作步骤：烤片约30min，二甲苯脱蜡，100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各5min，水洗，苏木精5min，水洗，1%盐酸酒精分化数秒，水洗，1%氨水返蓝，水洗，伊红3min，梯度酒精（低浓度至高浓度）脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2网织Gomori银染色

常规脱蜡至水，0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，水洗，1%草酸漂白至无色（1～2min），水洗，2%铁明矾溶液媒染5min，蒸馏水冲洗，浸银氨液40～60s，蒸馏水冲洗，10%甲醛还原10s，蒸馏水冲洗，5%硫代硫酸钠溶液固定2min，水洗，脱水、透明、封片。网状纤维呈黑色，胶原纤维呈棕色。

1.2.3免疫组织化学染色

常规脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10min,pH6.0柠檬酸盐抗原修复缓冲液热高压修复抗原2min，山羊血清封闭室温孵育10min，一抗Vaspin(1∶400稀释）和TGF-β（1∶200稀释）4℃孵育过夜，二抗30min,DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。

1.2.4结果判读

(1)肝脏炎症程度：依据炎症程度分为3级（G0～3):G0为无炎症；G1为腺泡3带呈少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死；G2为腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，汇管区轻、中度炎症；G3为腺泡3带广泛的明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，汇管区轻、中度炎症伴/或汇管区周围炎症。(2)肝脏纤维化程度：依据纤维化范围和形态分为4级（S0～4):S0为无纤维化；S1为腺泡3带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化；S2为纤维化扩展到汇管区，局灶性或广泛的汇管区星芒状纤维化；S3为纤维化扩展到汇管区周围，局灶性或广泛的桥接纤维化；S4为肝硬化。(3)免疫组织化学结果判读：随机采集10个高倍视野，染色显示胞浆棕黄色颗粒即为抗原阳性物，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；无阳性细胞为0分；阳性细胞数≤10%为1分，>10%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；两项计分相乘，结果0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.3统计学方法

数据分析采用SPSS19.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数和四分位数[M(P25,P75）]表示，比较用方差分析或秩和检验，两两比较用LSD-t检验或χ2检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；等级资料以等级表示，比较用秩和检验；相关性分析用Spearman法，影响因素的分析用多因素逐步Logistic回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组患者的临床病理特征

依据肝细胞脂肪变性占据小叶面积的范围分为5级：F0≤5%,F1>5%～30%,F2>30%～50%,F3>50%～75%,F4>75%。肝脏HE染色和Gomori银染色见图1。

各级NAFLD患者性别比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）。各级NAFLD患者年龄、身高、体重、体重指数（BMI）、血清总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、空腹血浆葡萄糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）比较，经方差分析，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

各级NAFLD患者炎症程度和纤维化程度比较，经秩和检验，差异无统计学意义（P>0.05）。各级NAFLD患者Vaspin和TGF-β表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05),NAFLD分级越高，Vaspin和TGF-β表达水平越低。见表2。

图1各组肝脏组织病理切片（HE染色×100)

2.2各组患者肝脏组织Vaspin和TGF-β的表达

Vaspin在正常肝脏组织肝细胞浆中会有少量表达，随着NAFLD肝脏脂肪变性的增加（F1～3），其表达也会升高；F4患者的脂滴在肝组织中越来越多，占肝细胞胞浆的体积越来越大，Vaspin表达似有降低。TGF-β主要表达在肝细胞胆管面的胞膜上，随着肝脏脂肪变性的增加，其表达降低。见表2和图2。

2.3肝脏组织Vaspin和TGF-β表达分级与其他各项指标的相关性

Vaspin表达分级与炎症程度、纤维化程度、TCHO、HDL-C、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、HbA1c无相关性（P>0.05）。Vaspin表达分级与TG呈负相关（P<0.05），与LDL-C、FPG呈正相关（P<0.05）。Vaspin阳性表达水平越高，TG越低，LDL-C和FPG越高。见表3。

表1各组患者临床病理特征比较

表2各组患者肝脏组织炎症、纤维化程度及Vaspin、TGF-β表达水平比较例

TGF-β表达分级与炎症程度、纤维化程度、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c无相关性（P>0.05）。TGF-β表达分级与ALP呈负相关（P<0.05),TGF-β表达水平越高，ALP越低。见表3。

2.4NAFLD的危险因素分析

脂肪肝组与非脂肪肝组患者的Vaspin和TGF-β表达分级，以及ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c比较，差异有统计学意义（P<0.05），脂肪肝组高于非脂肪肝组。两组TCHO、TG比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

以是否患脂肪肝为因变量，将单因素分析中差异有统计学意义的指标（Vaspin表达分级、TGF-β表达分级、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c）为自变量，进行多因素逐步Logistic回归，α入=0.05，。结果显示，Vaspin表达分级是发生NAFLD的独立危险因素。见表5。

表5NAFLD危险因素的多因素Logistic回归分析参数

图2各组患者肝脏组织Vaspin和TGF-β的表达（免疫组织化学染色×200)

表3Vaspin、TGF-β表达分级与其他指标的相关性

表4脂肪肝组与非脂肪肝组患者的临床资料比较

3、讨论

在NAFLD发生机制中，脂肪组织特别是内脏脂肪组织发挥着重要的作用。肥胖者身体脂肪分布位置的不同与NAFLD发生有关，脂肪分布于腹腔内脏比分布于腹壁具有更大的NAFLD发病风险[2]。脂肪组织是一个代谢活跃的内分泌器官，可通过自分泌/旁分泌分泌多种脂肪因子，包括激素、细胞因子、补体、生长因子、细胞外基质蛋白等，参与调节饮食、能量平衡及糖脂代谢等[9]。脂肪因子分两类：一类是脂肪细胞分泌的激素类，如脂连蛋白等；另一类是脂肪组织中的免疫细胞和内皮细胞分泌的炎症免疫相关的细胞因子，如TNF-α、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6）等[10]。脂肪因子不仅影响脂肪细胞的功能，而且可通过循环系统运送至其他器官及组织来影响代谢。脂连蛋白在NAFLD进展过程中发挥代偿作用，可以降低胰岛素抵抗，减少脂肪变性，有抗炎作用[11]；而TNF-α、IL-6增加胰岛素抵抗，有促炎作用，可使NAFLD病程恶化[12,13]。尤其高表达TNF-α联合低表达脂连蛋白可致胰岛素抵抗和NAFLD[14]。有研究证实，脂肪组织扩张可引起脂肪因子改变，进而导致肝单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis,NASH）及NASH相关肝硬化。脂肪因子作用的失衡是发生NAFLD或NASH，甚至肝纤维化的重要因素[15]。

目前，脂肪因子瘦素、脂连蛋白、抗胰岛素蛋白、内脂素、Chemerin等已在NAFLD人群、脂肪肝动物模型和2型糖尿病动物模型中被广泛研究[16,17]，其在NAFLD的发病机制基本清晰，但仍有很多脂肪因子与NAFLD发病的关系不清楚。脂肪因子对NAFLD的作用机制研究大多是在人群血清学水平，而人群肝脏组织的脂肪因子表达研究相对较少。肝脏中脂肪因子直接作用于肝脏，参与NAFLD进程，很多情况下与血液中脂肪因子的作用不一致，即脂肪因子的肝脏效应常常不能通过其在血液中的表达水平来反映[8]。

Vaspin是内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂，是一种从2型糖尿病大鼠的内脏脂肪组织中发现并分离的脂肪因子[18]。OLETF大鼠肥胖达到顶峰并出现胰岛素抵抗时，内脏脂肪和血浆Vaspin水平都明显升高，随着糖尿病病程恶化并伴随体重减轻，内脏脂肪和血浆Vaspin水平均明显下降，因此Vaspin是胰岛素敏感型脂肪因子[19]。Vaspin广泛表达于脂肪、肝脏、胃、下丘脑等组织。内脏脂肪组织来源的Vaspin可以抑制促炎脂肪因子的表达，如抗胰岛素蛋白、瘦素和TNF-α。人体血清Vaspin水平升高与BMI、胰岛素抵抗相关，低水平血清Vaspin是2型糖尿病进展的危险因素[20]。在高脂喂养小鼠模型中，血浆和肝脏Vaspin表达水平升高，这可能是机体对高脂饮食诱导的糖脂代谢负荷的代偿性调节，外源性Vaspin蛋白输注能够抑制高脂模型肝脏脂肪合成关键酶（脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶）的mRNA表达，促进脂肪分解限制酶（激素敏感性脂肪酶、肉毒碱棕榈酰转移酶）的mRNA表达[21]。本研究结果也显示，Vaspin在NAFLD患者肝脏组织中表达升高，并与血清LDL-C、FPG呈正相关，同时也是NAFLD的独立危险因素。Vaspin在正常肝脏组织肝细胞胞浆中有少量表达，随着NAFLD的进展，Vaspin表达进一步升高，并与肝脏组织纤维化呈正相关。在本研究中由于样本量较小，差异无统计学意义。有研究表明，肥胖人群血液中的Vaspin与TG、LDL-C密切相关[11]，这与本研究中肝脏组织高表达的Vaspin与血清LDL-C呈正相关一致。肥胖与NAFLD均为代谢综合征的表现，因而血液与肝脏中的Vaspin水平可能具有一致性。

参考文献：

[18]袁和菊,刘晶,李娜,等.Vaspin对2型糖尿病大血管病变的保护作用[J].国际内分泌代谢杂志,2019,39(4):261-264.

[21]吴光秀,周泽华,孙建娟,等.Vaspin对高脂喂养小鼠肝脏脂质聚集的影响[J].中国老年学杂志,2018,38(13):3206-3209.

陈香梅,张亮,齐立明,孙磊,王鹏.脂肪因子Vaspin在非酒精性脂肪性肝病中的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志,2021,31(06):37-43.