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TLR4/NF-κB信号通路探究下调miR-223对类风湿关节炎干预效果

2024-12-13 45 上传者：管理员

摘要：目的分析基于Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路探究下调miR-223对类风湿关节炎大鼠的干预效果。方法选取40只SPF级Wistar大鼠，10只作为对照组，其余建立类风湿关节炎模型，分为模型组、miR-223模拟物组、miR-223抑制剂组每组10只，建模成功后，miR-223模拟物组注射miR-223 mimic, miR-223抑制剂组腹腔注射miR-223 inhibitor,对照组、模型组注射生理盐水。结果与对照组相比，另外3组miR-223相对表达量、关节肿胀度、关节组织病理学评分、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、TLR4、NF-κB表达水平明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)表达水平明显降低(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组miR-223相对表达量、关节肿胀度、关节组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、TLR4、NF-κB表达水平明显升高，SOD表达水平明显降低，miR-223抑制剂组miR-223相对表达量、关节肿胀度、关节组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、TLR4、NF-κB表达水平明显降低，SOD表达水平明显升高(P<0.05)。结论下调miR-223表达可使类风湿关节炎大鼠关节肿胀度、关节组织病理学评分降低，并改善大鼠炎症因子水平，其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路被抑制有关。

关键词：
miR-223
Toll样受体4/核因子-κB信号通路
关节滑膜组织
关节炎
类风湿关节炎
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类风湿关节炎为慢性、全身性、涉及身体免疫功能的疾病，临床致残率较高，主要表现为机体关节功能下降、肿胀、疼痛，可对机体内关节滑膜组织造成损伤，对人类生活造成较大影响[1～3]。临床研究表明[4],类风湿关节炎的发展与Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路密切相关，可通过调节TLR4/NF-κB信号通路，对机体内炎症反应进行调节，减少机体内炎症反应。miRNA为内源性、单链小分子、非编码RNA,在多种真核生物中广泛存在，可通过对T、B淋巴细胞分化的调节，参与机体内免疫应答，在类风湿关节炎的发展中具有重要作用[5]。基于此，本文分析基于TLR4/NF-κB信号通路探究下调miR-223对类风湿关节炎大鼠的干预效果，为临床诊治提供参考。

1、材料与方法

1.1研究动物

选取40只SPF级SD大鼠，均为4～6周龄，体质量201～260 g,购自浙江苏可安药业有限公司[动物许可证号：SYXK(浙)2022-0009],24℃下饲养，这期间可自由饮水。

1.2分组与建模

10只大鼠作为对照组，另外30只建立模型[6],在大鼠尾静脉注射8 ml/kg的水合氯醛，后将完全弗氏佐剂、Ⅱ型胶原酶溶液(含有0.12 mol/L醋酸)混合，将1.5 ml混合剂注射于大鼠皮下，5 d后注射相同剂量乳剂，24 h后，大鼠足踝出现炎性肿胀，即为造模成功，后将其分为模型组、miR-223模拟物组、miR-223抑制剂组各10只。对照组注射等剂量生理盐水。miR-223模拟物组、抑制剂组分别注射miR-223 mimic、miR-223 inhibitor, 10μg/d, 1次/d,对照组、模型组注射同剂量生理盐水，连续注射8 w。

1.3病理组织观察

大鼠断颈处死后，取足踝关节滑膜组织，放入4%多聚甲醛，固定48 h,进行脱钙、脱水、石蜡包埋处理后，制作5μm切片，放入苏木素染液，5 min后取出，流水冲洗后再次放入，2 min后取出，使用中性树胶封片，采用显微镜观察。

1.4 miR-233相对表达量检测

取足踝关节滑膜组织，提取总RNA,对浓度、纯度进行测量，进行逆转录处理，采用逆转录-聚合酶链反应测定，反应条件：95℃ 变性30 s、95℃变性5 s、60℃30 s、68℃60 s,进行40个循环，进行40个循环，采用2-ΔΔCt方法计算出相对表达量。

1.5关节肿胀度、关节组织病理学评分检测

关节肿胀度：将大鼠固定好，于右侧后足踝关节处划线，后将右足放入测量杯，记录水面刻度，肿胀度=造模后容积-造模前容积。关节组织病理学评分：取关节组织切片，光学显微镜下观察，0分：正常，1分：轻微炎性浸润，2分：局部炎性浸润，3分：大量炎性浸润，4分：局部坏死。

1.6炎症因子水平、氧化应激损伤指标检测

取各组腹主动脉血，放入离心管，大鼠处死前，取空腹静脉血，以12 000 r/min离心处理10 min,取上层清液，采用酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平，在样品孔中加入50μl待测样品、不同浓度标准品，室温下孵育1 h,清洗后将底物A、B加入，37℃下孵育，15 min后，加入停止液，采用酶标仪检测TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD水平。

1.7 TLR4/NF-κB通路蛋白表达量检测

采用Western印迹法检测，取大鼠足踝关节滑膜组织，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液进行匀浆，离心处理取上层清液，采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，加入蛋白缓冲液，变性15 min后，进行电泳处理，加入5%脱脂奶粉，4℃封闭处理1.5 h,加入TLR4、NF-κB一抗，过夜处理，洗膜后，将二抗加入，30 min后洗膜，使用电化学发光(ECL)显影，对灰度值计算，分析蛋白表达。

1.8统计学处理

采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验和t检验。

2、结果

2.1各组足踝关节病理组织学

如图1所示，对照组足踝关节滑膜组织、关节囊正常；模型组滑膜内血管出现扩张，囊内韧带受损，炎性浸润加重，滑膜、纤维组织增生；miR-223模拟物组炎性细胞浸润更为严重，囊内韧带出现神经损伤明显；miR-223抑制剂组炎性细胞浸润减少，滑膜、纤维组织增生减少。

2.2各组关节组织miR-223相对表达量

如表1所示，与对照组相比，另外3组miR-223相对表达量明显升高(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组miR-223表达水平明显升高，miR-223抑制剂组miR-223相对表达量明显降低(P<0.05)。

2.3各组关节肿胀度、关节组织病理学评分对比

如表1所示，与对照组相比，另外3组关节肿胀度、关节组织病理学评分明显升高(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组关节肿胀度、关节组织病理学评分明显升高，miR-223抑制剂组关节肿胀度、关节组织病理学评分明显降低(P<0.05)。

2.4各组炎症因子水平对比

如表1所示，与对照组相比，另外3组炎症因子水平明显升高(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组炎症因子表达水平明显升高，miR-223抑制剂组炎症因子水平明显降低(P<0.05)。

2.5各组氧化应激损伤指标对比

如表1所示，与对照组相比，另外3组MDA水平明显升高，SOD水平明显降低(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组MDA水平升高，SOD水平降低，miR-223抑制剂组MDA表达水平降低，SOD表达水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1各组足踝关节病理组织学(×400)

表1各组关节组织miR-223相对表达量、关节肿胀度、关节组织病理学评分、炎症因子水平及氧化应激损伤指标比较

与对照组相比：1)P<0.05;与模型组相比：2)P<0.05;与miR-223模拟物组相比：3)P<0.05;下表同

2.6各组TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达量对比

如表2、图2所示，与对照组相比，另外3组TLR4、NF-κB表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比，miR-223模拟物组TLR4、NF-κB水平明显升高，miR-223抑制剂组TLR4、NF-κB水平明显降低(P<0.05);与miR-223模拟物组相比，miR-223抑制剂组TLR4、NF-κB水平明显降低(P<0.05)。

表2各组TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达量对比

图2各组TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达

3、讨论

类风湿关节炎临床发病率较高，为自身免疫性疾病，临床病情复杂，具有较多并发症，且临床复发率较高，易导致患者关节畸形，且难以治愈，对患者生活、工作具有较大影响[7,8]。随着生活方式的逐渐改变，类风湿关节炎发病率逐渐升高，临床发病机制尚未明确，疾病早期，主要采用糖皮质激素、非甾体抗炎药物进行治疗，该类药物可对患者临床症状进行改善，故分析类风湿关节炎发病机制，寻找合适的生物指标，对于类风湿关节炎的早期治疗具有重要意义[9,10]。

研究显示[11],miRNA可参与自身免疫性疾病、肿瘤、呼吸系统疾病的发生，外泌体中miRNA可避免血清中RNA酶的降解，可对机体生理过程进行调节。研究表明[12],树突细胞的外泌体可在受体细胞膜TNF-α中进行作用，使NF-κB通路被激活，动脉内血管内皮炎症程度增加，并使机体动脉硬化粥样程度加重。类风湿关节炎发病与外泌体相关，核酸等生物分子至供体细胞转至受体细胞时，可参与受体细胞内信号通路，并对其信号通路过程造成影响[13,14]。miR-223高表达于类风湿关节炎患者滑膜组织，可参与类风湿关节炎的发生发展[15,16]。研究显示[17,18],miR-223在miRNA中较为常见，在多种细胞、组织、炎症反应中广泛存在，miR-223在类风湿关节炎患者中表达升高，miR-223可参与破骨细胞的生长、发展，抑制miR-223表达，可使关节炎评分降低。该研究与本研究一致，表明对miR-223活性进行抑制可用于类风湿关节炎的治疗。TLR4为首次发现的TLRs, TLR4可激活体内免疫系统，且进行磷酸化反应后，可使NF-κB定植于细胞中，释放TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子[19～21]。TLRs可参与类风湿关节炎的发病，且活动期患者体内TLR4表达增加，可调控其病情严重程度[22,23]。NF-κB为转录因子，存在于细胞质中，TLR4被激活后可促使NF-κB激活，增加炎性基因表达，促进TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症细胞因子产生[24]。NF-κB可对炎性基因表达水平进行调节，且在类风湿关节炎的发生、发展中具有重要作用[25]。本文研究表明，抑制miR-223表达，减少机体内炎症反应，减轻大鼠关节损伤。

综上，下调miR-223表达，可抑制类风湿关节炎大鼠体内病变，改善关节损伤，其作用机制可能与抑制大鼠的TLR4/NF-κB通路相关。

参考文献:

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