骨性关节炎的病理特征是软骨、骨骼、滑膜、韧带、肌肉和关节周围脂肪的变化，从而导致关节疼痛、僵硬和功能受限[1]。骨性关节炎的发病人数约占世界人口的13%，世界卫生组织将其称为“第一致残疾病”，对于患者的生活质量产生了极大的危害[2]。目前的医疗策略不能完全治愈该疾病的致病过程，而只能减缓症状或延缓疾病的进展[3]。因此，寻找骨性关节炎新的治疗手段刻不容缓。在骨性关节炎发展的多个阶段均已观察到滑膜异常，越来越多的证据表明它可能在骨性关节炎病理中起重要作用[4]。研究表明骨性关节炎滑膜中2-氧戊二酸5-双加氧酶2的表达随着骨性关节炎的严重程度而增加[5]；还有研究发现在滑膜中检测到基因PPP2R5C、EXT1、HS6ST与GSTT1表达水平的升降与骨性关节炎的严重程度密切相关[6]。骨性关节炎的发病机制尚未完全明确，尽管目前有关骨性关节炎发病机制的基础研究已取得显著进展，但对这种疾病的认识仍需进一步提高[7]，因此，发现骨性关节炎新的治疗靶点及其参与的信号通路是目前医学领域所关注的热点。

此次研究将从美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合数据库中搜索所有骨性关节炎滑膜组织基因芯片数据集并下载其中符合实验要求的基因芯片数据集4组，通过整合生物信息学法联合加权基因共表达网络分析(weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA)算法筛选出健康对照组和骨性关节炎患者滑膜组织之间的关键基因；通过分析目标基因的生物学功能和途径，可以在分子水平上进一步了解骨性关节炎，为骨性关节炎的诊断、治疗和实验研究提供理论依据。

1、对象和方法

1.1 设计

基因学实验，采用t检验进行两组间均数差异的比较。

1.2 时间及地点

实验于2020年9-11月在广西中医药大学第一附属医院分子实验室完成。

1.3 对象

于2020年9-11月收集来自广西中医药大学第一附属医院4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者的手术废弃滑膜组织用于PCR验证，患者均为男性，年龄40-50岁，患者之间无亲缘关系。该研究方案已经广西中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。

实验组纳入标准：(1)参考《骨关节炎诊疗指南(2018版)》属于原发性骨性关节炎，即无创伤、炎症、劳损等诱因；(2)符合骨性关节炎诊断标准，有关节疼痛、僵硬、活动障碍，影像学检查提示骨赘形成，关节间隙变窄，需要进行手术治疗者；(3)年龄40-50岁；(4)签署知情同意书。

实验组排除标准：(1)属于风湿性关节炎、痛风性关节炎者；(2)有乙肝、结核、梅毒等传染性疾病者；(3)合并有严重心脑血管疾病、恶性肿瘤等原发性疾病者；(4)不适宜手术治疗的患者。

对照组纳入标准：(1)有创伤史；(2)因外伤导致关节处骨折或韧带损伤，需要进行手术治疗的患者；(3)年龄40-50岁；(4)签署知情同意书。

对照组排除标准：(1)伴有骨性关节炎患者；(2)有乙肝、结核、梅毒等传染性疾病者；(3)合并有严重心脑血管疾病、恶性肿瘤等原发性疾病者；(4)不适宜手术治疗的患者。

1.4 资料

从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因表达综合数据库中搜索所有骨性关节炎滑膜组织相关的基因芯片数据，下载符合实验要求的基因芯片数据集4组，其系列号为GSE1919、GSE41038、GSE55235和GSE82107，这4个数据集均来源于人滑膜；GSE1919包含5例骨性关节炎患者和5例健康对照；GSE41038包含3例骨性关节炎患者和4例健康对照；GSE55235包含10例骨性关节炎患者和10例健康对照；GSE82107包含10例骨性关节炎患者和7例健康对照。共使用4个数据集，包括28个骨性关节炎样本和26个健康对照样本。

1.5 实验方法

1.5.1 差异表达基因筛选

使用Perl(https://www.perl.org/，5.32.0版本)软件注释4个数据集系列矩阵文件的探针，将探针的名称转换为基因名；同一基因对应的所有探针的表达值取平均表达值。使用R软件中的Limma包，筛选整合的基因表达矩阵中骨性关节炎的差异表达基因；使用t检验后基因符号的相应P值，并将调整后的P<0.05和|log2FC|≥1用作选择标准。用R语言软件中的Pheatmap软件包用于绘制可视化的差异表达基因热图。

1.5.2 差异表达基因的京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)和基因本体论富集分析

在此次实验中基于R语言软件工具将筛选出的差异表达基因进行了基因本体论富集分析和KEGG途径富集分析；P<0.05被认为差异有显著性意义。

1.5.3 免疫细胞浸润

通过R软件中的limma包将基因矩阵转换为免疫细胞的矩阵；根据CIBERSORT官网(https://cibersort.stanford.edu)的免疫细胞中单细胞测序数据，使用R语言软件包比对计算出各样本中免疫细胞的浸润情况；根据P<0.05筛选样品，并计算样品中每种免疫细胞的百分比。

1.5.4 蛋白质相互作用网络构建和Degree值前10差异表达基因的获取

STRING数据库主要整合了来源不同的基因表达数据，如高通量测序数据、共表达数据以及实验相关数据等，构建一种特殊的根据基因之间的结合分数来评价蛋白间相关度的体系[8]。将通过R语言软件筛选出差异表达基因通过STRING在线工具得到的相关差异表达基因文本文件，将其导入Cytoscape(https://cytoscape.org/，3.8.0版本)软件编辑可视化蛋白质相互作用网络；通过R语言软件构建Degree得分前10差异基因的可视化条形图。

1.5.5 WGCNA数据来源及数据预处理

将上述4组基因芯片数据集放入同一文件夹，用于后续基因共表达模块的构建。

1.5.6 共表达网络的构建和关键基因的获取

使用R语言软件中的WGCNA软件包来构建所有差异表达基因的基因共表达模块；将正负相关性最高的基因模块，鉴定为通过WGCNA算法获取的关键基因模块。

1.5.7 目标基因

将蛋白质相互作用网络中Degree值前10的差异表达基因与通过WGCNA算法所获得的相关性最高模块的基因运用R语言软件中的Venn图获取交集，来得到目标基因。

1.5.8 PCR实验验证

于2020年9-11月收集来自广西中医药大学第一附属医院4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者的手术废弃滑膜组织用于PCR验证，患者均为男性，年龄40-50岁，患者之间无亲缘关系。使用TRIzol试剂(Takara，中国大连)从滑膜组织中提取总RNA，在37℃60min、95℃5min的反应条件下将来自总RNA的RNA样品反转录为cDNA,PCR分析使用2×UniversalSYBRGreenFastqPCR混合物(ABclonal，中国武汉)进行，条件如下：95℃2min，然后95℃5s40个循环，60℃30s。记录每个基因的循环阈值(Ct),GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达量。引物序列见表1。

1.6 主要观察指标

采用实时荧光定量PCR检测4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者滑膜组织中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3的表达差异。

1.7 统计学分析

所有分析均使用SPSS20.0和https://secure.graphpad.com/，5.0版本进行。计量资料用表示，采用t检验进行两组间均数差异的比较，P<0.05表示差异有显著性意义。

2、结果

2.1 筛选的差异基因

根据校正后的P<0.05和|log2FC|≥1作为标准，从所有数据集中总共获得107个差异表达基因；包括46个上调的差异表达基因和61个下调的差异表达基因；绘制可视化热图，见图1。

2.2 基因本体论和KEGG富集分析结果

基因本体论富集分析结果表明，生物学过程中的差异表达基因生物学过程主要是骨化的形成、细胞黏附的正调控、对应激的反应、淋巴细胞活化的阳性调节和对皮质类固醇的反应等；细胞成分中差异表达基因成分主要是胶原蛋白；在分子功能中差异表达基因分子功能主要是受体配体活性、信号受体激活剂活性和细胞外基质结构成分，以下列举了差异表达最明显的前10个基因，见图2及表2。

KEGG通路主要富集在类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B通路，以下列举了差异表达最明显前10的信号通路，见图3及表3。

2.3 免疫浸润分析结果

通过CIBERSORT算法共得到22种免疫细胞，结果以小提琴图显示，见图4,P<0.05被认为差异有显著性意义。小提琴图结果表明在骨性关节炎患者滑膜组织中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞和滤泡辅助性T细胞含量较高。

2.4 蛋白质相互作用网络和筛选出的Degree值前10的差异表达基因

为了进一步研究差异表达基因在蛋白质水平上的相互作用，根据STRING数据库中得到的文本文件，利用Cytoscape(https://cytoscape.org/，3.8.0版本)软件进行可视化编辑构建了一个蛋白质相互作用网络，见图5；通过R语言软件，根据Degree得分构建可视化条形图，见图6。

列出10个Degree最高的差异表达基因：基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3、血管内皮生长因子A、Ⅰ型胶原A1重组蛋白、基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、前胶原C-蛋白酶增强蛋白、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3。

2.5 WGCNA相关性最高基因模块筛选结果

WGCNA算法结果表明，MEpink模块是正负相关性最强的模块，其包含174个基因，见图7。

2.6 交集基因的获取

将WGCNA算法获取的174个基因与蛋白质相互作用网络中Degree前10的差异表达基因利用R语言软件中Venn分析法取交集，见图8；其中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是获得的交集基因。

2.7 PCR检测验证结果

PCR结果表明，基质金属蛋白酶1在骨性关节炎患者滑膜和关节创伤患者滑膜中无明显差异；金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3在骨性关节炎患者滑膜组织中表达量下调，并且差异有显著性意义(P<0.05)，见图9。

3、讨论

骨性关节炎是骨科常见疾病之一，其发病率有逐年上升的趋势，这严重威胁着人们的生活质量；探索骨性关节炎的分子机制，找出潜在的诊断及预后的生物标志物，具有重要意义。基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3、血管内皮生长因子A、Ⅰ型胶原A1重组蛋白、基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、前胶原C-蛋白酶增强蛋白、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是此次实验所得到蛋白质相互作用网络中Degree值前10的差异表达基因，为了更好地了解差异表达基因的作用机制，作者对其进行了基因本体论、KEGG通路富集分析；此外，为了提高此次实验结果的准确性，通过联合WGCNA算法获取两者的交集基因，并对其进一步分析。

基因本体论分析表明，生物学过程中的差异表达基因生物学过程主要涉及骨化的形成。骨化广义是指骨组织的生成过程，而狭义指成骨细胞在骨基质中发生钙质沉着。临床和实验室证据均表明，骨性关节炎中软骨下骨代谢的改变可能是由于成骨细胞行为异常所致[9]；骨骼微环境中的成骨细胞、造血细胞、内皮细胞和神经细胞系统之间动态相互作用的破坏会导致骨骼不健康，并增加对骨性关节炎的易感性[10]。白细胞介素6可能通过激活Janus激酶-信号转导和转录蛋白激活子信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路来调节成骨细胞的分化和增殖[11]。白细胞介素6属于促炎细胞因子中的重要一员，促炎细胞因子被认为在骨性关节炎中起主要作用[12]；白细胞介素6与骨化的过程密切相关，抑制骨化的过程对骨性关节炎治疗具有重要的意义。

KEGG通路主要富集在类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路。类风湿性关节炎和骨性关节炎是影响关节的常见慢性疾病，尽管发病机制不同，但在临床表现与细胞和分子基础之间存在一定的相似性[13]。类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，会引起关节发炎、软骨破坏和骨侵蚀[14]；骨性关节炎是一种常见的退行性疾病，其特征在于关节软骨的破坏和周围组织的慢性炎症[15]；两者都可见关节炎症和软骨破坏等表现。核因子κB转录因子家族是许多细胞信号通路的多效性调节因子，调控细胞对多种与炎症相关的刺激做出反应[16]；核因子κB信号通路能够参与如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1等炎症因子的介导[17]，炎症机制在骨性关节炎病理生理中起着关键作用，研究发现在骨性关节炎患者外周血和滑液样品中促炎细胞因子水平升高[18]。受体酪氨酸激酶/蛋白激酶B信号通路与骨性关节炎发病密切相关，在病理条件下，受体酪氨酸激酶/蛋白激酶B信号通路能够减少软骨细胞凋亡，从而来预防骨性关节炎的发生[19]。细胞外基质由软骨细胞合成，其合成和分解平衡维持软骨稳态[20,21]，关节软骨细胞外基质在骨性关节炎的发展中起着重要作用，若其合成与降解失衡将导致骨性关节的发生[22]。

通过免疫浸润分析发现骨性关节炎患者滑膜组织中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞含量较高；而T细胞滤泡助手和T细胞CD4记忆激活含量较低。巨噬细胞集落刺激因子是破骨细胞增殖和存活所必需的因子[23]；成骨细胞、破骨细胞和间充质干细胞在内的关节细胞的代谢调节中也起着主要作用。M1巨噬细胞分泌的一种蛋白质Rspo2在骨性关节炎的发展中起着重要作用[24];NAKAJIMA等[25]研究表明Rspo2可能参与软骨内骨化；而软骨内骨化是骨性关节炎发生的标志之一[26]。

基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3为此次实验得到的4个目标基因。基质金属蛋白酶1是一种间质胶原酶和成纤维细胞胶原酶，在正常的生理和病理过程中会促进细胞外基质的分解[27]。基质金属蛋白酶1可以通过c-JunN末端激酶和细胞外调节蛋白激酶途径加速骨髓间充质干细胞的成骨分化，骨髓间充质干细胞的“成骨-成脂”分化平衡对于维持健康的骨稳态是必不可少的[28]。有学者在骨性关节炎中发现基质金属蛋白酶1表达量的增加[29]，基质金属蛋白酶1能够降解软骨[30]，在骨性关节炎的病理中存在软骨钙化，针对软骨钙化的治疗有机会成为骨性关节炎新型的治疗策略[31]。尽管很多研究发现基质金属蛋白酶1和骨性关节炎关系密切，但是通过PCR实验验证发现基质金属蛋白酶1在骨性关节炎患者和关节创伤患者滑膜组织中的表达量并未表现出明显差异性，基质金属蛋白酶1对于骨性关节炎的作用机制有待进一步研究。

金属蛋白酶组织抑制剂4是金属蛋白酶的组织抑制剂家族中的重要一员；研究表明，金属蛋白酶组织抑制剂是调节组织细胞外基质降解的基质金属蛋白酶的抑制剂[32]；基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质参与许多生理和病理过程[33]。ZHAO等[34]研究发现颞下颌关节骨性关节炎期间软骨破坏的主要原因是细胞外基质降解；而WANG等[35]表明通过阻断白细胞介素1β结合增强自噬减弱细胞外基质降解可能是骨性关节炎的潜在治疗策略。此外，金属蛋白酶组织抑制剂4的表达显著降低，将导致金属蛋白酶增加，从而引起病理性软骨破坏[36]，软骨破坏是骨性关节炎重要的病理机制之一。PCR实验结果表明金属蛋白酶组织抑制剂4在骨性关节炎患者滑膜组织中表达量下调，推测上调金属蛋白酶组织抑制剂4的表达量将会抑制骨性关节炎的发病。

层粘连蛋白亚基α3是一种分泌蛋白，属于层粘连蛋白家族。细胞外基质主要由层粘连蛋白、纤连蛋白、Ⅰ，Ⅳ型胶原蛋白组成[37]；层粘连蛋白亚基α3是参与细胞外基质沉积和转换的重要基因之一[38]，细胞外基质的降解是导致骨性关节炎发病的主要原因之一[39]。层粘连蛋白亚基α3编码了一种由巨噬细胞缺氧诱导的蛋白，可有效调节血管生成[40]。血管生成是指新血管的生长，其在骨性关节炎的发病机制中至关重要[41]。血管内皮生长因子家族在血管生成中发挥关键作用[42]，膝关节骨性关节炎患者滑液中的血管内皮生长因子水平与膝骨关节炎严重程度呈正相关[43]；滑膜诱导的血管生成是骨性关节炎发病机制的核心[44]。作者认为层粘连蛋白亚基α3可能通过调控细胞外基质的功能和血管生成对骨性关节炎的发病产生重要影响。

卵泡抑素3是一种结合并抑制转化生长因子β配体作用的糖蛋白[45]。转化生长因子β是一种多用途细胞因子，在许多细胞功能中发挥作用，例如增殖、分化、迁移、凋亡、细胞黏附和上皮向间质转化的调控[46]。转化生长因子β1属于转化生长因子β家族重要成员之一，转化生长因子β1作为软骨细胞中最重要的因子之一，可促进软骨前体细胞分化以及软骨细胞的增殖、迁移和代谢[47]。有研究表明软骨细胞的增殖，能诱导大鼠骨性关节炎的发生[48,49]。此外，转化生长因子β1能够促进细胞外基质沉积，上文已经提到细胞外基质沉积是骨性关节炎发病的重要诱因之一。因此，作者考虑卵泡抑素3能够通过调控转化生长因子β的表达对骨性关节炎的发病产生抑制作用。

综上所述，推测类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B信号通路都与骨性关节炎的发病相关；金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是治疗骨性关节炎的重要靶基因，并且促进金属蛋白酶组织抑制剂4和卵泡抑素3的表达量对于骨性关节炎的发生发展具有防治作用。虽然此次研究存在一定局限性，例如：仅从滑膜样本中探讨，缺乏全面性；选取基因芯片数据样品量较少。但是，此次研究运用整合生物信息学法联合WGCNA算法并且通过PCR实验验证提高了实验结果的准确性和科学性，这对于寻找骨性关节炎的治疗靶点具有重要意义。

参考文献:

[8]罗磊,龚宝成,刘福团.GSE74602芯片数据中直肠癌关键基因与治疗药物的生物信息学筛选[J].中国普通外科杂志,2018,27(4):.457-467.

[13]刘金富,曾平农焦,等.整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J].中国组织工程研究;2021,25(23).3690-3696.

[16]卢文豪,周雪灵,任义昆等.电针上调Cezanne表达抑制NF-xB信号通路介导的大鼠脑缺血/再灌注炎性损伤[J].第三军医大学学报,2021,43(4)283-294.

[37]蒋锐,於子卫.细胞外基质在周围神经修复组织工程学中应用的研究进展[J].听力学及言语疾病杂志,2018,26(5):556-560.

文章来源：陈财,曾平,刘金富,钱晓芬,陆冠宇,熊波,陈莉华,黄悦.基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证[J].中国组织工程研究,2022,26(12):1907-1914.