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钩藤碱通过Nrf2/HO-1信号通路抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤

2023-07-12 62 上传者：管理员

摘要：探讨钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎症等损伤的影响及其分子机制。方法将大鼠软骨细胞分为对照组、IL-1β(10 ng/mL)组、IL-1β+钩藤碱(5、25、50μmol/L)组；MTT实验检测钩藤碱对细胞活性的影响；Western blot方法检测Bcl2、Bax、MMP3、MMP13、CollagenⅡ、Nrf2和HO-1蛋白水平；ELISA方法检测炎性因子PGE2、COX-1、TNF-α和ROS水平；试剂盒检测MDA水平。结果与对照组相比，IL-1β组细胞活性明显抑制(P<0.05);与IL-1β组相比，钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组细胞活性增强(P<0.05)。与对照组相比，IL-1β组Bcl2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加(P<0.05);与IL-1β组相比，钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组Bcl2蛋白表达增加，钩藤碱50μmol/L组Bax蛋白表达减少(P<0.05)。与对照组相比，IL-1β组MMP13和MMP3蛋白表达上调，CollagenⅡ蛋白表达下调(P<0.05);与IL-1β组相比，钩藤碱5、25和50μmol/L组MMP13和MMP3蛋白表达降低，钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组CollagenⅡ蛋白表达增加(P<0.05)。与对照组相比，IL-1β组PGE2、COX-1、TNF-α、ROS和MDA水平均升高(P<0.05);与IL-1β组相比，钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组PGE2、COX1、TNF-α、ROS和MDA水平均降低(P<0.05)。与对照组相比，IL-1β组Nrf2和HO-1蛋白表达减少(P<0.05);与IL-1β组相比，钩藤碱25μmol/L组和50μmol/L组Nrf2和HO-1蛋白表达增加(P<0.05)。结论钩藤碱通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎症等损伤。

关键词：
NF-E2相关因子
白介素1β
血红素氧合酶1
软骨细胞
钩藤碱
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骨关节炎(osteoarthritis, OA)是关节软骨渐进性退行的一种疾病，大多发生于65岁以上的老年人[1]。随着人口老龄化程度的加重，OA发病率呈逐年上升趋势，是导致中老年人生活质量下降甚至残疾的重要疾病之一[2]。目前，OA的常规治疗方法包括物理治疗和抗炎镇痛药物干预等，但治疗效果并不理想[3],所以仍需探寻更安全、有效的治疗方法。钩藤碱(rhynchophylline, Rhy)为茜草科钩藤的有效成分之一，其药理活性丰富。研究证实，钩藤碱可改善中枢神经系统疾病、心血管疾病[4],具有抗炎、抗氧化作用[5],但钩藤碱是否在OA中发挥作用需进一步探讨。

NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作为转录因子，负责调节细胞氧化还原平衡[6]。在氧化应激刺激下，Nrf2开启细胞防御机制，进入细胞核并与具有ARE序列的基因结合，如血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)诱导靶基因的表达，从而发挥抗氧化作用。研究发现，钩藤碱通过Nrf2/ARE信号通路激活减轻Aβ1-42诱导的神经细胞氧化应激，对神经细胞起保护作用[5]。然而钩藤碱对OA的影响是否与Nrf2/HO-1信号通路有关需进一步明确。因此，本研究通过IL-1β诱导软骨细胞，探讨钩藤碱对软骨细胞损伤的保护作用以及钩藤碱对Nrf2/HO-1信号通路的激活作用，为临床上治疗OA提供新的依据。

1、材料与方法

1.1材料

药物与试剂：钩藤碱购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco公司；MTS检测细胞活力试剂盒购自Sigma Aldrich公司；Bcl2、Bax、MMP3、MMP13、Ⅱ型胶原蛋白(collagen typeⅡ,CollagenⅡ)、Nrf2、HO-1、GAPDH抗体和兔二抗购自Abcam生物公司；ELISA试剂盒和MDA试剂盒购自碧云天生物公司。蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)、酶标仪(美国Molecular公司)、细胞培养箱(美国Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1原代SD大鼠软骨细胞分离及培养：

在无菌条件下，处死4周大的SD大鼠，收集膝关节和股骨头软骨。PBS洗涤后，将软骨切成小块放入胰蛋白酶-EDTA(0.25%)消化液和DMEM培养基中消化2 h。将软骨细胞接种于25 cm2的细胞培养瓶培养细胞。本研究符合河南省中医院·河南中医药大学第二附属医院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准(KY20210321)。

1.2.2实验分组：

将细胞随机分为对照组、IL-1β组、钩藤碱组。对照组为正常生长、不作干预的软骨细胞；IL-1β组为10 ng/mL IL-1β诱导的软骨细胞；钩藤碱组为预先加入低、中、高浓度(5、25、50μmol/L)的钩藤碱处理细胞，然后再用10 ng/mL IL-1β诱导的软骨细胞。

1.2.3 MTT检测细胞活性：

将以上各组细胞接种在96孔板，在不含钩藤碱或含有钩藤碱(5、25、50μmol/L)条件下培养24 h,加入20μL MTT放置37℃、5%CO2细胞培养箱，避光放置2 h,波长490 nm由酶标仪设置测定。

1.2.4 Westernblot检测蛋白表达：

蛋白样品在SDS-PAGE上电泳后转移到PVDF膜进行转膜，根据蛋白分子量的大小计算转膜时间，用5%脱脂奶粉在室温封闭2 h,用一抗孵育，4℃过夜，二抗在室温孵育2 h,采用ECL发光液检测蛋白表达情况。

1.2.5 ELISA检测炎症因子和ROS:

收集各组细胞上清，按照厂家说明书，使用ELISA试剂盒进行检测。

1.2.6 MDA检测：

收集细胞，加入裂解液，冰上裂解10 min,离心12 000 r/min, 10 min,取上清于新的离心管。根据试剂盒说明书设置标准曲线，检测细胞MDA值。[LM]

1.3统计学方法

采用Gradpad Prism 8进行统计学分析。实验至少重复3次，数据用平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Bonferroni检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1钩藤碱缓解IL-1β诱导的软骨细胞生长抑制及凋亡

MTT方法检测软骨细胞活性，结果发现与对照组比较，IL-β诱导的软骨细胞活性受到抑制(P<0.05);然而与IL-β诱导的软骨细胞组比较，25、50μmol/L的钩藤碱处理后，软骨细胞活性明显增强(P<0.05)。Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白，结果发现与对照组比较，IL-1β组Bcl2蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增加(P<0.05);与IL-1β组比较，浓度为25、50μmol/L的钩藤碱组Bcl2蛋白水平增加(P<0.05),浓度为50μmol/L的钩藤碱组Bax蛋白水平减少(P<0.05)。见图1。

图1钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞生长以及凋亡的影响

2.2钩藤碱缓解IL-1β诱导的软骨细胞外基质分解代谢

Western blot方法检测细胞外基质(extracellular matrix, ECM)分解代谢相关蛋白，结果发现与对照组比较，IL-1β组MMP13和MMP3蛋白表达显著增加(P<0.05),CollagenⅡ蛋白表达显著减少(P<0.05);与IL-1β组比较，浓度分别为5、25和50μmol/L的钩藤碱组MMP13和MMP3蛋白水平减少(P<0.05),浓度为25、50μmol/L的钩藤碱组CollagenⅡ蛋白水平提高(P<0.05)。见图2。

图2钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞ECM分解代谢的影响

2.3钩藤碱阻碍IL-1β诱导的软骨细胞炎症介质的产生

ELISA方法检测炎症介质结果见表1,IL-1β诱导软骨细胞后，PGE2、COX-1和TNF-α的分泌量增加(P<0.05);与IL-1β组相比，25、50μmol/L浓度的钩藤碱显著降低PGE2、COX-1和TNF-α的分泌量(P<0.05)。

表1钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞中PGE2、COX-1和TNF-α水平的影响

2.4钩藤碱减轻IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激损伤

与对照组相比，IL-1β组的MDA浓度和ROS水平均升高(P<0.05);与IL-1β组比较，浓度为25、50μmol/L的钩藤碱处理组中MDA浓度和ROS水平均明显下降(P<0.05)。见图3。

图3钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激损伤的影响

图4钩藤碱对IL-1β诱导的软骨细胞Nrf2/HO-1通路的影响

2.5钩藤碱可激活Nrf2/HO-1通路

Western blot方法检测结果见图4,IL-1β诱导软骨细胞明显抑制Nrf2和HO-1蛋白表达(P<0.05);与IL-1β组相比，浓度为25、50μmol/L的钩藤碱处理组增加Nrf2和HO-1蛋白表达(P<0.05)。

3、讨论

越来越多的证据表明，IL-1β诱导的细胞可促进软骨细胞凋亡[7,8]。文献报道，姜黄素通过抑制NF-κB信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞凋亡[9]。同时，研究发现，在动物和各种细胞模型中，钩藤碱对多种疾病具有保护作用[10,11]。因此，本研究首先用IL-1β诱导大鼠原代软骨细胞构建骨关节炎模型，再加入钩藤碱(5、25和50μmol/L)处理细胞，结果发现浓度为25、50μmol/L的钩藤碱增加Bcl2的蛋白表达，而浓度为50μmol/L的钩藤碱降低Bax的蛋白表达，提示一定浓度的钩藤碱可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡。

ECM是由胶原蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白、水和矿物质组成的，占软骨干重的90%,因此，ECM降解和破坏是OA发展的关键因素[12]。其中，CollagenⅡ是关节软骨的主要结构蛋白。若CollagenⅡ结构破坏，软骨降解酶(如MMP3、MMP9和MMP13)增加，会加速OA的发生[13]。因此，本文利用钩藤碱处理IL-1β诱导的软骨细胞，结果发现钩藤碱浓度为5、25和50μmol/L时可抑制MMP3和MMP13的蛋白表达，而钩藤碱浓度为25、50μmol/L时增加CollagenⅡ的蛋白水平，这说明钩藤碱可抑制ECM分解，有效缓解软骨细胞损伤。

当氧化还原状态处于动态平衡时，ROS和RNS作为第二信使调控细胞内信号转导途径；一旦氧化还原状态失衡，产生过量的ROS和RNS,造成细胞和组织出现氧化应激现象，不利于细胞和组织的生长[14,15,16]。氧化应激是导致许多疾病发生的关键因素，包括肿瘤[17]、心血管疾病[18]和OA[19]等。研究表明，ROS积累诱导胰腺癌肿瘤细胞的生长和转移，促进胰腺癌的进展[17]。有文献报道TDP-43减少氧化应激引起的软骨细胞损伤，抑制OA的发展[20]。因此，研究如何减少氧化应激是保护软骨细胞免受损伤的重要方面。

钩藤碱作为钩藤重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化作用。据报道，钩藤碱抑制JAK2/STAT3通路改善慢性炎症疾病哮喘的炎症，同时提高气管平滑肌细胞的抗氧化能力[21]。然而，钩藤碱在OA中是否发挥抗炎、抗氧化作用尚不明确。因此，本实验利用IL-1β诱导的软骨细胞作为细胞损伤模型，浓度为25、50μmol/L钩藤碱处理后结果发现细胞炎症介质PGE2、COX-1和TNF-α分泌减少，同时MDA和ROS水平均下降，提示钩藤碱在软骨细胞损伤中具有抗炎、抗氧化作用。

为了研究钩藤碱在IL-1β诱导的软骨细胞损伤中如何发挥抗炎、抗氧化作用。研究发现，激活Nrf2/HO-1通路可改善骨骼肌细胞氧化还原状态，利于骨骼肌细胞的增殖[22]。同时，有研究表明，在溃疡性结肠炎体内体外模型中，Nrf2/HO-1通路减轻细胞和小鼠的炎症现象，促进其生长[23]。本实验结果发现浓度为25、50μmol/L钩藤碱提高Nrf2和HO-1的蛋白水平，该结果提示钩藤碱可能通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗炎、抗氧化作用。

综上所述，本实验证实了钩藤碱可激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和ECM降解，降低MMP3、MMP13蛋白表达以及MDA和ROS水平，增加CollagenⅡ蛋白表达，发挥抗炎抗氧化作用，从而保护软骨细胞免受损伤。此外，钩藤碱在OA中的作用还需大量实验研究才可作为治疗OA的潜在药物。

参考文献:

[2]褚云峰,于红燕,杨琪,等.白藜芦醇在骨关节炎中的作用及机制研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(9):1351-1355.

[3]程晏,石文俊,张磊,等.瘀血痹片联合抗骨质疏松症药物对膝骨关节炎的临床疗效及膝关节功能评分的影响研究[J].中国骨质疏松杂志,2021,27(6):882-889.

基金资助:河南省中医药科学研究专项课题(2019ZYBJ18);

文章来源:王西彬,左瑞庭,王新立等.钩藤碱通过Nrf2/HO-1信号通路抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(07):966-970+986.