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淫羊藿苷对大鼠膝骨性关节炎关节功能及软骨保护的作用机制

2024-05-10 158 上传者：管理员

摘要：目的探讨淫羊藿苷对大鼠膝骨性关节炎(KOA)关节功能及软骨保护的作用机制。方法将30只SD大鼠随机均分为假手术组、模型组和淫羊藿苷组。模型组与淫羊藿苷组采用膝关节前交叉韧带离断法进行造模。淫羊藿苷组给予淫羊藿苷[100 mg/(kg·d)]灌胃干预，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃干预，时间均为8 w。采用膝关节活动度、旷场实验、步态分析检测评估关节功能；采用软骨组织大体观及Pelletier评分及番红-固绿染色与国际骨关节炎研究学会评分评估关节软骨的退变程度；采用酶联免疫吸附试验检测软骨组织代谢血清标志物Ⅱ型胶原交联羧基端肽(CTX-Ⅱ)、大鼠脱二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的含量。采用Western印迹检测软骨组织基质金属蛋白酶(MMP)-13、MMP-1、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)的蛋白表达水平。结果与假手术组相比，模型组运动总距离、总穿格数、中央区滞留时间均显著下降(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组上述3个指标均显著上升(P<0.05)。与假手术组相比，模型组关节活动度显著降低(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组关节活动度显著提高(P<0.05)。与假手术组相比，模型组血清中软骨组织代谢标志物CTX-Ⅱ、DPD含量均显著升高(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组以上指标均显著降低(P<0.05)。与假手术组相比，模型组膝关节软骨中MMP-1、MMP-13蛋白表达显著升高，Aggrecan、CollagenⅡ蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组MMP-1、MMP-13蛋白表达显著降低，Aggrecan、CollagenⅡ蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论淫羊藿苷可以显著改善大鼠KOA的关节软骨退变程度及功能，其作用机制与提高大鼠软骨代谢血清标志物CTX-Ⅱ、DPD含量，促进软骨组织合成代谢标志物Aggrecan、CollagenⅡ蛋白表达，抑制软骨组织分解代谢标志物MMP-13、MMP-1蛋白表达有关。

关键词：
KOA
关节功能
淫羊藿苷
膝骨性关节炎(KOA)
软骨
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膝骨性关节炎(KOA)以关节软骨的退行性改变为主要病理特征，以关节疼痛、肿胀和僵硬为主要临床表现，是临床上最常见的老年病之一，常导致患者关节功能障碍，严重影响患者生活质量[1]。根据最新流行病学研究显示，KOA呈现出年轻化，全球已有超过3.02亿人受此影响[2,3]。目前，对尚未达到手术治疗标准的KOA患者最新治疗指南建议使用镇痛的非甾体抗炎药及控制体质量、锻炼等改善患者生活方式的治疗方案[4]。但是，临床上常用的非甾体抗炎药多具有明显副作用，且无法阻止KOA进展。因此，为了在KOA长期治疗中取得成功，亟待寻找更好的治疗药物[5]。近年来，淫羊藿苷对KOA的治疗作用备受关注，体内外研究显示，淫羊藿苷能通过多靶点、多途径对KOA起治疗作用，并且无明显毒副作用[6,7]。本研究探讨淫羊藿苷对KOA关节功能及软骨保护的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠(雄性，SPF级)30只，8周龄，体质量180～220 g, 由湖北省实验动物研究中心提供[实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018],本实验经湖北省中医院伦理委员会审核批准，实验动物均于湖北省中医院[实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0095]饲养。

1.2 主要试剂

淫羊藿苷(英国Abcam公司);番红-固绿(SO)染色试剂盒、无水乙醇、中性树胶二甲苯、多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司);Ⅱ型胶原交联羧基端肽(CTX-Ⅱ)、脱二氢嘧啶脱氢酶(DPD)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、基质金属蛋白酶(MMP)-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、MMP-13、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)一抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器

小动物行为分析软件(上海欣软信息科技有限公司);量角器；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);脱水机、组织摊片机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司);旷场试验箱(北京智鼠多宝科技有限责任公司);离心机(湖南湘仪实验仪器公司);酶标仪(无锡华卫德朗仪器有限公司);电泳仪、脱色摇床、电泳仪槽(北京市六一仪器厂)。

1.4 大鼠KOA模型制备与分组

30只SD大鼠经随机数字表法分为假手术组、模型组和淫羊藿苷组。模型组与淫羊藿苷组采用前交叉韧带离断(ACLT)法建立KOA模型[8]。造模方法：2%戊巴比妥钠溶液(1.0 ml/400 g)腹腔麻醉后，大鼠右膝关节备皮、消毒后，在关节内侧纵行切开2 cm切口，逐层显露并切开关节囊，暴露前交叉韧带并离断，冲洗、缝合手术切口。术后连续3 d给予青霉素(40万U/kg)肌注预防切口感染。假手术组仅切开膝皮肤及关节囊，不做前交叉韧带离断。

1.5 干预方法

造模后淫羊藿苷组给予淫羊藿苷[100 mg/(kg·d)]灌胃干预[9],假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃干预，时间均为8 w。

1.6 旷场实验

造模后第8周进行，测试前将大鼠放入旷场实验箱适应30 min(底边100 cm×100 cm, 高40 cm),正上方2 m处架一视野可覆盖整个旷场内部的数码摄像头，并允许大鼠在3 min测试期内自由活动，用计算机软件记录运动总距离、总穿格数、中央区域滞留时间，评估大鼠焦虑、抑郁状态。

1.7 关节活动度检测

采用2%戊巴比妥钠溶液(1.0 ml/400 g)腹腔麻醉大鼠后，用量角器测量右膝关节被动屈伸的最大角度，两角度差值即为膝关节活动度[10]。

1.8 膝关节软骨组织大体观及Pelletier评分

Pelletier评分标准依据关节软骨表面的完整度、光滑度、色泽分为5级，分数范围为0～5分，关节软骨表面完整度、光滑度、色泽越差，Pelletier分级越高，对应的分数越高[11]。

1.9 膝关节软骨组织形态学检测与国际骨性关节炎研究学会(OARSI)评分

采用SO染色对软骨组织进行形态学检测。首先，离断大鼠右膝关节，4%多聚甲醛固定24 h, 10%乙二胺四乙酸脱钙4 w, 再经脱水、包埋、切片(厚度为4 μm的软骨组织)、最后根据SO试剂盒方法进行染色。采用OARSI评分标准对软骨组织病理改变进行量化分析[12]。该评分方法在每个标本中选择一个有代表性的切片，根据OARSI评分规定评估软骨退变的程度(分级)和范围(分期),OARSI评分=分期×分级。总分为24分，分值越高，软骨退变越严重。

1.10 ELISA检测血清CTX-Ⅱ、DPD含量

处死各实验大鼠后腹主动脉取血，离心(4 ℃,3 500 r/min, 10 min),取上清后置于-80 ℃冰箱冻存备用。ELISA检测方法按试剂盒说明书操作。

1.11 Western印迹检测软骨组织中MMP-1、MMP-13、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达

处死大鼠后，剥离膝关节软骨组织，用组织裂解液提取总蛋白，BCA蛋白分析试剂盒测定浓度，经分离、电泳、转膜、封闭，一抗4 ℃冰箱孵育过夜。二抗37 ℃ 2 h, TBST漂洗3次后显影，用Quantity One软件对蛋白条带分析，测定灰度值，GADPH作为内参蛋白，结果用靶蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值进行表示。

1.12 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

2、结果

2.1 各组旷场实验

与假手术组相比，模型组运动总距离、总穿格数、中央区滞留时间均显著降低(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组以上指标显著上升(P<0.05)。见表1。

2.2 各组关节活动度检测

与假手术组相比，模型组关节活动度显著降低(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组关节活动度显著提高(P<0.05)。见表1。

2.3 各组膝关节软骨大体观与Pelletier评分

如图1所示，从大体观看，假手术组膝关节软骨面多光滑、完整、有光泽。模型组关节软骨面多形态改变、凹凸不平(蓝色箭头所示)、肥大、硬化且无光泽，大量软骨面剥脱(黑色箭头所示),滑膜组织增生(黄色箭头)。淫羊藿苷组部分软骨组织糜烂(红色箭头所示)、剥脱(白色箭头所示),欠光泽，但软骨面形态基本正常。与假手术组相比，模型组Pelletier评分显著升高(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组Pelletier评分显著降低(P<0.05)。见表1。

2.4 各组组织学检测与OARSI评分

如图2所示，假手术组关节软骨细胞排列整齐，表层软骨及细胞外基质完整，仅软骨面表层稍粗糙(白色箭头所示),OARSI分级1～2级，病变范围大多累及局部软骨面；模型组多呈现出软骨组织正常结构被破坏，软骨细胞大量死亡，软骨形态改变，纤维结缔组织替代软骨组织(黑箭头所示),囊肿形成(黄色箭头所示),软骨组织内出现裂隙，OARSI分级5～6级，病变范围累及整个软骨组织；淫羊藿苷组多呈现为软骨细胞部分死亡，软骨表层不完整，软骨组织内出现裂隙(红色箭头所示),囊肿形成(黄色箭头所示),但软骨组织形态基本正常，OARSI分级3～4级。与假手术组相比，模型组OARSI评分显著升高(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组OARSI评分显著降低(P<0.05)。见表1。

2.5 各组血清DPD、CTX-Ⅱ含量

与假手术组相比，模型组血清中软骨组织代谢标志物CTX-Ⅱ、DPD含量均显著升高(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组血清中软骨组织代谢标志物CTX-Ⅱ、DPD含量均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组旷场实验、关节活动度、关节软骨Pelletier与OARIS评分及血清CTX-Ⅱ、DPD含量比较

图1 各组膝关节股骨髁大体观

图2 各组膝关节股骨髁(SO染色，×100)

2.6 各组软骨组织CollagenⅡ、Aggrecan、MMP-1、MMP-13蛋白表达

与假手术组相比，模型组膝关节软骨组织中MMP-1、MMP-13蛋白表达显著升高，CollagenⅡ、Aggrecan蛋白显著降低(P<0.05);与模型组相比，淫羊藿苷组MMP-1、MMP-13蛋白表达显著降低，CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组软骨组织MMP-13、MMP-1、Aggrecan、CollagenⅡ蛋白表达比较

图3 各组软骨组织MMP-13、MMP-1、Aggrecan、 CollagenⅡ蛋白表达

3、讨论

KOA已成为造成老年人关节疼痛和残疾最主要的原因之一[13]。国外流行病学研究显示，到2030年，西欧和北美将有超过20%的成年人患有KOA,每年因KOA产生的医疗支出已对全球的医疗卫生系统造成了严重经济负担[14]。目前，临床缺乏治疗KOA有效且长期服用安全的药物。淫羊藿苷作为一种广泛用于治疗各种疾病的补充药物，一直备受关注，现代药理研究表明，淫羊藿苷具有较好的镇痛、抗炎、调节免疫等作用[15,16,17]。Tang等[18]研究证实，淫羊藿苷可改善KOA大鼠模型的软骨退变，其机制可能与调节磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路有关。研究证实，淫羊藿苷可通过促进软骨细胞分化、减少软骨细胞凋亡、促进软骨细胞分泌特定的细胞外基质成分在KOA中起软骨保护作用[19,20,21]。但淫羊藿苷对KOA的关节功能及软骨保护作用机制仍不完全清楚。

本研究显示，前交叉韧带离断后可引起膝关节不稳，进而诱发膝关节出现KOA。Jeon等[22]研究显示，大鼠经ACLT术后可出现关节滑膜炎、软骨组织蛋白多糖含量和胶原结构改变、晚期骨赘形成、软骨下骨重建、软骨细胞凋亡等KOA典型的病理生理特征，因此，采用ACLT法建立KOA动物模型已被广泛认可并应用于各类探索KOA发病机制及药物疗效评估的实验。

关节活动度能直接反映各组大鼠关节功能情况，本研究结果显示，淫羊藿苷能显著改善KOA大鼠模型的关节活动障碍。本研究结果表明，淫羊藿苷对KOA大鼠模型的关节活动具有显著改善作用，能显著改善KOA大鼠模型的关节软骨退变。

DPD、CTX-Ⅱ是常见的软骨组织代谢血清标志物，能间接反映软骨组织的代谢状态，血清DPD与CTX-Ⅱ含量越高，表明软骨组织分解代谢越强，关节软骨呈退变趋势。本研究结果显示，淫羊藿苷可显著降低KOA大鼠血清中的DPD及CTX-Ⅱ含量，这可能与其改善关节软骨退变有关。软骨组织代谢主要是指细胞外基质(ECM)代谢，ECM主要由CollagenⅡ和Aggrecan组成，其蛋白水平可间接反映软骨组织的合成代谢水平。而MMP能够参与分解ECM中所有成分，其蛋白表达水平可间接反映软骨组织的分解代谢水平。MMP-1和MMP-13经研究证实是导致ECM分解最主要的酶[23]。ECM在正常膝关节软骨中保持合成与分解的平衡状态，被称作是软骨代谢的一种内稳态[24]。而这种内稳态的破坏也被看作是软骨退变的主要原因之一[25]。本研究结果说明，淫羊藿苷延缓KOA大鼠关节软骨退变还与恢复关节软骨组织的分解合成代谢平衡有关。

综上，淫羊藿苷可显著改善大鼠KOA的关节软骨退变程度及功能，其作用机制与提高大鼠血清CTX-Ⅱ、DPD含量，恢复关节软骨组织的分解合成代谢平衡有关。但淫羊藿苷对CTX-Ⅱ、DPD、CollagenⅡ、Aggrecan、MMP-1和MMP-13等软骨代谢标志物的内在调节作用机制仍不清楚，还有待通过体内外恢复实验进行确认。

参考文献:

[1]中华医学会骨科学分会关节外科学组.骨关节炎诊疗指南(2018年版)[J].中华骨科杂志,2018;38(12):705-15.

[10]周晓红,李柏村,李佳,等.从肝论治取穴针灸治疗膝骨关节炎模型大鼠关节功能与昼夜节律的关系[J].中国组织工程研究,2021;943(14):66-72.

[11]邹志余,周劲松,肖昆林,等.姜黄素对单碘乙酸诱导的膝骨关节炎大鼠的治疗作用[J].西安交通大学学报(医学版),2020;41(2):299-303.

基金资助:湖北省卫生健康委员会项目(WJ2021M182);

文章来源:丰瑞兵,黄勇,胡昊,等.淫羊藿苷对大鼠膝骨性关节炎关节功能及软骨保护的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(09):2197-2201.