类风湿关节炎(RA)是由免疫系统异常攻击机体主要关节部位，导致持续性自身免疫性疾病，伴随滑膜组织炎症、骨侵蚀及关节正常结构的破坏[1]。随着人口老龄化的进展，RA的老龄化也在增长[2]。鉴于老年人生理和病理特性，老年发病的RA与非老年发病的RA在临床表现和治疗等方面存在诸多差异[3]。现代医学针对老年发病的RA,依旧采用非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、改变病情的抗风湿类药物(DMARDs)作为主要治疗手段，然而老年人的特殊体质致使其对风湿药物的副作用尤为敏感[4]。生物制剂虽可在短期内缓解病情，可费用高昂、安全性不明及远期作用难以预测等问题，限制了其在临床中的应用[3]。因此，迫切需求从传统民族药中寻找和开发高效、低毒的抗风湿药。润僵五味汤由栀子、苦参、诃子、川楝子、肋柱花等5味药组成；出处是《通瓦嘎吉德》(19世纪吉格木德丹僧扎木苏),主要用于陈旧性热症、隐伏热症，用于污血和精血相混症。本研究通过网络药理学研究方法，探究润僵五味汤对 RA 治疗的分子作用机制，为更深入研究提供依据。

1、资料与方法

1.1 润僵五味汤有效成分与基因靶点的获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),并根据现有文献分别搜集润僵五味汤5味药的化学成分，利用TCMSP数据库对得到的5味药的有效成分作用靶点进行筛选。

1.2 润僵五味汤治疗RA基因靶点的获取

使用人类基因综合数据库(GeneCards, 预测分数阈值大于8)、人类疾病相关基因与突变位点信息数据库(DisGeNET)、药物靶标数据库(TTD)、药物遗传学和药物基因组学数据库(PharmGKB),输入Rheumatoidarthritis检索RA的疾病靶点。将上述疾病靶点与筛选后的有效成分作用基因靶点取交集。

1.3 药物-成分-靶点-疾病网络的建立

将5味药、筛选后的各药物有效成分、RA的基因靶点与疾病导入Cytoscape3.9.1软件，绘制药物-成分-靶点网络。

1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)网络与润僵五味汤治疗RA基因靶点分析

将润僵五味汤治疗RA的作用靶点上传至STRING数据库(https: //cn.string-db.org/)中，从而获取蛋白相互作用关系，并导入Cytoscape3.9.1软件绘制PPI网络。使用R对获取的基因靶点进行基因本体(GO)功能分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

1.5 分子对接

分别在蛋白质结构数据库(PDB)(http: //www.pdb.org)和ZINC(https: //zinc.docking.org)数据库中获取蛋白和小分子结构pdb文件。利用pymol对蛋白大分子进行除水去自带配体等处理，小分子用chem3D进行结构最优化处理。用AutoDock对蛋白质和小分子进行加氢，小分子进一步确定扭转键，保存为pdbqt文件后，用autogrid进行对接区域设置，然后导出对接区域信息文件，利用AutoDockVina软件进行分子对接。

2、结果

2.1 润僵五味汤有效成分

TCMSP数据库搜索并结合文献挖掘，共获得润僵五味汤有效成分132种，作用靶点242个。将得到的有效成分和基因靶点导入Cytoscape3.9.1软件中，使用cytoHubba算法工具对导入数据进行分析，得到排名前5的有效成分为：槲皮素、木犀草素、山萘酚、熊果酸、芦丁。

2.2 润僵五味汤治疗RA的作用靶点

分别在GeneCards、TTD、DisGeNET、PharmGKB中输入“Rheumatoidarthritis”,检索RA的疾病作用靶点，得到疾病靶点943个。将得到的润僵五味汤作用基因靶点和RA作用靶点取交集，得到润僵五味汤治疗RA的作用基因靶点64个。

2.3 药物-成分-疾病靶点网络的建立

将润僵五味汤药物、药物成分、药物-疾病共有靶点导入Cytoscape3.9.1软件，绘制“药物-成分-靶点”图，见图1。每个图案表示一个节点，连线表示各个节点的联系。圆形图案中心为润僵五味汤单药白色图案表示，围绕中心单味药绿圆形排列的是5味单药对类风湿关节炎起作用的有效成分，深绿色图案表示润僵-5味汤治疗RA的作用靶点，红色代表五味药共有的有效成分。

图1 “润僵五味汤-有效成分-靶点-疾病”网络

2.4 PPI网络的构建

将得到的64个润僵五味汤治疗RA的作用靶点导入STRING数据库，得到PPI网络，然后再将得到的数据导入Cytoscape3.9.1绘制PPI网络，见图2。网络中节点代表蛋白，边表示蛋白之间的相互作用，共涉及64个节点，693条边。使用Cytoscape3.9.1软件中cytoHubba算法工具对PPI网络进行分析，得到度(degree)值大于35的综合排名前10联系最为密切的靶点：基质金属蛋白酶(MMP)9、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)2、细胞间黏附分子(ICAM)1、核因子(NF)-κB 抑制蛋白alpha(NFKBIA)、血管细胞黏附分子(VCAM)1、信号转导和转录激活因子(STAT)1、Toll 样受体(TLR)4、v-akt 鼠胸腺细胞瘤病毒癌基因同源物(AKT)1、白细胞介素(IL)1α、TLR2。

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将64个润僵五味汤治疗RA的关键靶点导入DAVID数据库，设置物种为人类，进行生物过程和通路富集分析。将富集结果取前10位制作条形富集图，见图3。通过GO功能分析发现基因靶点涉及的生物过程(BP)包括细胞因子调控、NF-κB信号转导、细胞对氧化应激的反应、DNA结合转录因子活性的正调控、凋亡信号通路负调控等；细胞组分(CC)主要涉及膜微区、膜筏、膜区、质膜外侧等；分子功能(MF)主要涉及蛋白质同源二聚化活性、转录调控区序列特异性DNA结合、大分子复合物结合等。通过KEGG通路富集分析发现，Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、细胞凋亡、NF-κB信号通路、IL-17信号通路是其主要途径，见图4。

图2 润僵五味汤治疗RA的PPI网络

图3 润僵五味汤治疗RA的作用靶点GO分析

2.6 分子对接

将核心靶点MMP9、PTGS2、NFKBIA 等分别同润僵五味汤的主要有效成分槲皮素、木犀草素、山萘酚、熊果酸与芦丁实施分子对接。结果见表1。倘若结合能<0,说明配体分子都能够与受体蛋白自发结合，且结合能越小对接效果越佳。根据表中数据能够得知，最低结合能均≤-5.9 kCal/mol, 说明配体与受体蛋白的结合性能良好。其中，PTGS2 与芦丁的对接为最低结合能。

图4 润僵五味汤治疗RA的作用靶点KEGG分析

表1 分子对接结果

3、讨论

RA是一种以慢性、对称性、致残性关节炎为主要特征的系统性自身免疫疾病。它所侵犯的主要靶器官为关节滑膜，也能侵犯浆膜、肺、心脏、血管、神经系统、眼等组织器官[3]。在蒙医学中，将RA称作“陶赖”病，觉得此疾病是因为情志受损、饮食起居不当而导致三根七素失衡，赫依与血相搏，黄水偏多，浊热余邪侵犯关节，阻碍气血运行所引发[5]。近些年来，蒙医蒙药在对本病的认知和治疗方面取得了一定的进步。蒙药的治疗疗效确切，能够有效改善RA病情，并且蒙药药材属于纯自然植物，可以多靶点作用于人体的各个系统，副作用较小[6]。依据 PPI 网络筛选的结果，本研究推断 MMP9、PTGS2、ICAM、NFKBIA、VCAM1 等基因属于润僵五味汤医治 RA 的核心作用靶点。研究发现MMP9可降解软骨中的纤维胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ和蛋白多糖[7],同时MMP9可促进成纤维细胞迁移、炎症细胞浸润，导致软骨的破坏[8,9,10,11]。PTGS2在一般情况下表达水平较低，在巨噬细胞经过促炎刺激后高表达[12]。PTGS2 的上游受到经典的NF-κB信号通路的调控[13]。NFKBIA 是 NF-κB 的抑制因子，可以阻止 NF-κB 信号通路的激活[14]。近年来发现巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、ICAM-1、VCAM-1与 RA 的发病紧密关联[15]。ICAM-1和VCAM-1均属于免疫球蛋白超家族成员。ICAM-1在细胞间及滑膜细胞与细胞外基质之间的黏附过程中起着关键作用，这种黏附作用可诱导滑膜细胞的迁移和增殖，从而引发一系列病理改变。相比之下，VCAM-1在正常情况下表达较低，但在机体受到炎性因子刺激时，其表达量会上调，促使免疫细胞(特别是单核细胞和淋巴细胞)紧密黏附于内皮细胞，进一步推动炎症反应的发展和免疫细胞的浸润[16,17]。

蒙药治疗RA的重要手段之一是调节相关信号通路。本研究揭示，润僵五味汤的关键成分能够集中作用于RA的疾病信号通路，这表明其治疗RA的机制是通过调节这些信号通路来实现的。其中，TLRs信号通路是关键的一环。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受体，能够识别微生物的病原相关分子模式(PAMPs)及宿主自身损伤细胞产生的损伤相关分子模式(DAMPs),在天然免疫中扮演重要角色。当TLRs与这些分子结合后，会启动一系列的信号转导过程，从而引发免疫反应[18]。TNF信号通路在全身的炎症反应中发挥着关键作用。当TNF与相应的受体结合后，会触发一系列的反应，包括促进血管内皮生长因子的增殖与迁移，及影响血管内皮细胞分泌一些促血管再生因子。这些过程对血管再生产生阻碍作用，从而可能导致骨与软骨的损伤。在RA的病理过程中，TNF信号通路会导致TNF-α因子水平显著升高，进一步加剧机体的炎性反应[19,20]。与此同时，NF-κB信号通路也是免疫反应和炎症过程中重要的调节因子之一。这一通路在细胞反应系统中占据重要地位，能够调控多种细胞因子的活性，如TNF-α、IL-1β、IL-6及脂多糖等。当TNF-α、IL-1等与相应的受体结合并被激活后，NF-κB会被激活并进入细胞核。在细胞核内，经过磷酸化作用后，NF-κB与特定的启动子结合，促进核转录过程，从而上调炎性细胞因子的分泌，导致细胞炎症的产生。这种炎症反应会通过正反馈机制进一步激活NF-κB信号通路，形成一个持续的炎症反应循环[21,22,23]。IL-17信号通路在炎症反应中扮演着关键角色，特别是在RA的发病过程中。该通路能够通过激活多种信号分子，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、Janus 激酶(JAK)及STAT等，进一步促进NF-κB激活物衔接蛋白(ACT1)的活化。这一连串的反应最终导致炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α及MMP的释放，从而加剧了炎症反应[24]。IL-17信号通路不仅参与了RA发病早期的进行性炎症过程，还与晚期骨破坏的形成密切相关。

本研究发现，木犀草素、槲皮素、山萘酚、熊果酸和芦丁可能是润僵五味汤治疗RA 的重要活性成分。山萘酚具有抗氧化、抗炎等作用，可负调控 NF-κB、MAPK 等信号通路，减少 TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子的分泌[25,26]。木犀草素具有抗炎、抗过敏、抗氧化等作用[27,28,29,30],通过多种渠道参与免疫调节，包括抑制活性氧及活性氮的产生，调节花生四烯酸的代谢及调控炎性信号通路的传导，抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达[31]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫调节和抑制关节滑膜组织增殖等多种活性，在延缓 RA 病理进程中发挥起到作用[32,33]。槲皮素具有抑制炎性介质的分泌与释放的作用，机制与调控 NF-κB密切相关[34]。熊果酸具有抗炎[35,36]、抗骨质疏松、免疫调节等作用[37,38],能显著减轻胶原诱导关节炎CIA大鼠关节的病理改变，降低大鼠关节中 TNF-α、IL-17 和前列腺素(PG)E2 的表达[39]。芦丁具有促进 MH7A 细胞(人RA滑膜成纤维细胞)增殖的作用[40]。

综上，润僵五味汤医治RA作用机制与调控相关信号通路、调节机体免疫功能、调控细胞凋亡、抑制炎症反应相关，具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特性。

参考文献:

[1]中成药治疗优势病种临床应用指南标准化项目组.中成药治疗类风湿关节炎临床应用指南(2022年)[J].中国中西医结合杂志,2023;43(3):261-73.

[2]盛苏红.老年类风湿关节炎的发病特点及辨证分型的临床观察[D].南京:南京中医药大学,2019.

[3]贾冬梅.解毒活血汤联合甲氨蝶呤治疗老年发病类风湿关节炎的临床研究[D].济南:山东中医药大学,2009.

[4]蒋明,林孝义,朱立平,等.中华风湿病学[M].北京:华夏出版社,2004:1458-60.

[5]中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书[M].上海:上海科学技术出版社,1992:250.

[6]白埔,信莎莎,董玉.蒙药治疗类风湿性关节炎的研究进展[J].内蒙古医科大学学报,2015;37(S1):12-5.

[15]向导,袁林,苏林冲,等.金边祛风饮对类风湿关节炎滑膜细胞IL-1β､TNF-α及MMP-3表达的影响[J].中国免疫学杂志,2013;29(9):952-4,959.

[16]安新,高利常,张英杰,等.类风湿关节炎患者血清白细胞介素-32细胞间黏附分子-1白细胞介素-10的检测及意义[J].山西医药杂志,2014;7(1):13-6.

[17]王志文,丁春菊,张爱国,等.麝香乌龙丸对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理形态及血管内皮生长因子､内皮抑素表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011;17(19):241-4.

[18]唐媚,胡松,唐信威,等.成纤维样滑膜细胞Toll样受体在类风湿性关节炎的研究进展[J].成都医学院学报,2014;9(2):217.

[19]章敏,高梅,陈镜宇,等.类风湿性关节炎血管增生的机制研究进展[J].安徽医科大学学报,2018;53(4):649-52.

[23]吕邵娃,王秋实,赵爽,等.中药调控类风湿性关节炎核因子 κB 信号 通路 的研 究进 展[J].细胞与分子免疫学杂志,2015;31(11):1580-3.

[24]杨威,荣晓凤.白细胞介素-17 在风湿病中的作用及中医药干预研究进展[J].风湿病与关节炎,2023;12(2):75-80.

[26]石璐,孙文燕.基于网络药理学探讨芍药甘草汤治疗类风湿关节炎的作用机制[J].中草药,2020;51(24):6246-57.

[33]黄敬群,孙文娟,王四旺,等.尿酸钠致急性痛风性关节炎模型大鼠与槲皮素的抗炎作用[J].中国组织工程研究,2012;16(15):2815-9.

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金项目(2020MS08030);

文章来源:黎明,苏景明,白塔那.基于网络药理学探讨润僵五味汤治疗类风湿关节炎的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(12):2876-2881.