骨性关节炎是一种关节退行性疾病,严重影响患者的生活质量。随着社会发展,人均寿命的延长,其发病率呈上升趋势,在65岁以上的人群中有50%以上为OA患者[1]。相关研究表明,2020年OA将会发展成为第四大致残性疾病,给患者、家庭及社会造成巨大的经济负担[2]。

OA目前临床上多采用对症治疗,早期多采用非甾体抗炎药或关节腔注射软骨保护剂[3,4],中晚期则行关节腔清理术或者关节置换术[5]。长期服用非甾体类抗炎药不良反应较大,手术创伤大且治疗费用比较昂贵。中医药治疗OA具有疗效明显、不良反应小、价格低廉的特点。近年来,相关研究表明黄柏单药或以PCC为君药的药方对OA有一定的防治效果[6,7,8],但其作用机制尚不明确。网络药理学是一种新兴技术,能多层次-多靶点-多功能-多通路地阐释药物治疗疾病的机制[9]。因此,本研究运用网络药理学探究PCC治疗OA的机制,以期为中药治疗OA的实验方向以及临床运用提供参考。

1、方法

1.1选取黄柏活性成分及靶点预测

在中药系统药理学分析平台(traditionalChinesemedicinesystemspharmacologydatabaseandanalysisplatform,TCMSP)数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索黄柏的潜在药效成分。口服生物利用度和类药性指数是网络药理学用于筛选有效成分的常用指标,口服生物利用度(oralbioavailability,OB)是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度。类药性指数(druglikeindex,DL)是指化合物与已知药物的相似性。中药的活性成分必须具有较高的成为药物的可能性,并且能被人体利用。有研究认为,OB>30%符合人体对药物的利用程度,DL>0.18意味着该成分具有成药性的可能[10,11]。因此本研究选用上述两个指标对该药药效成分进行筛选后选取合适的成分。在TCMSP网站中收集对PCC有效活性成分可能作用的潜在蛋白靶点,把结果放入Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库对蛋白名称进行统一,得到药物的潜在作用靶点。

1.2检索骨性关节炎的相关靶点

在GeneCards(https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)(https://www.omim.org/)等网站以“Osteoarthritis”为关键词进行检索,下载疾病相关靶点。

1.3筛选药物-疾病的共同靶标基因

运用Venny2.1软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对1.1项下和1.3项下结果进行比对,筛选出PCC与OA的共同靶标基因,并使之可视化。

1.4构建与分析蛋白相互作用网络

STRING数据库(https://stringdb.org/)是一个能够在线搜索已知的蛋白相互作用关系并使之以网络图的形式呈现的数据库,把1.3项下共同靶标基因用STRING数据库进行检索,设定物种为“Human”(人类),在设置中设定“Highconfidence”为0.7,其余设定不变,出现PCC治疗OA潜在靶标的相互作用关系图后,导出关系图的TSV格式文件。运用R语言软件(Rx643.6.0)对TSV文件中的每个基因邻接节点的个数即基因的关键程度进行统计并排序后,进行可视化。

1.5构建黄柏活性成分-靶点-骨性关节炎疾病网络

采用Cytoscape3.7.1软件构建“PCC活性成分-靶点-OA疾病”网络,设置网络节点、边等属性。其中,节点代表成分或作用靶点,边代表成分与靶点相互作用关系。根据节点和边数计算成分、靶点相应节点平均度(成分与靶点关联的平均程度),将PCC的药效成分与OA作用靶标导入Cytoscape3.7.1软件,构建其PCC活性成分-靶点-OA疾病网络。

1.6基因本体分析与京都基因以及基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析

运用Cytoscape3.7.1软件中的“ClueGo”插件对预测出的PCC治疗OA的靶点进行基因本体分析(GO分析)和KEGG通路富集分析。对预测的PCC治疗OA的生物学过程以及关键信号通路进行探讨。

2、结果

2.1黄柏活性成分以及潜在作用靶点获取

运用TCMSP数据库,根据OB和DL等参数初步筛选后获得PCC的有效活性成分37个。筛选的有效成分具体见表1。PCC的潜在作用靶点共有78个。

表1PCC成分分布表

2.2骨性关节炎的相关基因靶点

在Genecard和OMIM数据库中检索OA的相关基因靶点,对重复靶点进行合并与剔除后,得到相关基因靶点2470个。

2.3黄柏成分与骨性关节炎的共同靶标基因

把OA的相关基因靶点2470个与PCC的潜在作用基因靶点进行交集,得到共同靶标基因共45个,PCC有可能通过以上45个共靶对OA起治疗作用。见图1。

图1PCC-OA共靶Venn图

2.4蛋白质相互作用网络分析

将2.3项下得到的45个共同靶标基因输入STRING数据库,查看“Analysis”,平均节点度为4.36个,平均聚类系数为0.541,P-value<1.0e-16,说明靶点的交互作用明显。获得PCC治疗OA的关键靶点共41个,关键程度前30位见图2。其中竖轴为关键靶点名称,横轴为Degree(每个基因邻接节点的个数)。如图所示,Degree排名前5位的靶点分别为:IL6(degree=14),CASP3(degree=13),MYC(degree=12),RELA(degree=11),CCND1(degree=10)。

图2PCC治疗OA的关键靶点(排名前30)

2.5黄柏活性成分-靶点-OA疾病网络的构建及分析

在上述研究基础上构建PCC活性成分-靶点-OA疾病网络图,详见图3。图中共涉及节点64个,边141个,椭圆形代表PCC,椭圆形周围的矩形节点代表PCC的活性成分,八边形代表OA疾病,八边形周围的矩形节点代表PCC作用于OA的共同靶标基因。在该网络图中,所有活性成分都至少与2个以上作用靶点相连接,其中quercetin(槲皮素,degree=46)、beta-sitosterol(β-谷甾醇,degree=8)、(S)-Canadine[=(S)-tetrahydroberberine,四氢小檗碱(degree=4)]、Fumarine(=Protopine,原阿片碱,degree=4)以及Cavidine(卡文定碱,degree=4)的连接度较高,可能是PCC防治OA的重要活性成分。图中每个活性成分都对应了多个靶标,每个靶标也与各种活性成分相连接;说明PCC治疗OA具有多成分、多靶点的特点。

图3PCC成分-靶点-OA疾病网络

2.6黄柏治疗骨性关节炎的基因本体分析

使用Cytoscape3.7.1软件中的ClueGO插件对45个与治疗OA相关的靶点进行GO富集分析,选取P<0.001的结果,进行可视化。纵轴代表PCC治疗OA的生物过程的重要性,排名越靠近上方重要性越高。横轴代表该生物过程在治疗过程中的占比。柱状条的数字代表该生物过程富集的靶点个数。由图4可知,PCC治疗OA的相关生物学过程共有35个条目,重要性排名前5位的分别有:软骨细胞分化的正调控(positiveregulationofchondrocytedifferentiation);胚胎下肢形态发生(embryonichindlimbmorphogenesis);氧化应激导致的细胞凋亡(celldeathinresponsetooxidativestress);核苷酸结合寡聚化结构域信号通路(nucleotide-bindingoligomerizationdomaincontainingsignalingpathway)以及酮反应(responsetoketone)。

图4PCC治疗OA的GO分析条形图

2.7黄柏治疗骨性关节炎的KEGG通路富集分析

通过Cytoscape3.7.1软件中的ClueGO插件对45个与治疗OA相关的靶点进行KEGG富集分析,选取P<0.001的结果进行可视化。图示意义参考[2].6项下。由图5可知,PCC治疗OA的相关通路共有47个条目,重要性排名前5位的通路分别有:药物代谢(drugmetabolism);流体剪切应力与动脉粥样硬化通路(fluidshearstressandatherosclerosis);NF-κB信号通路(NF-kappaBsignalingpathway);HIF-1信号通路(HIF-1signalingpathway)以及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications)。

图5PCC治疗OA的KEGG分析条形图

3、讨论

《素问·阴阳应象大论》云:“故善用针者,从阴引阳,从阳引阴,以右治左,以左治右。”《素问·刺法论》又云:“正气存内,邪不可干。”中医治疗疾病,向来着重于从整体调节生物体的功能,以达到治疗疾病的目的。而网络药理学亦注重从整体调控的角度研究药物对生物网络调控的作用。网络药理学作为传统中药学与现代药理学的桥梁,正逐渐被中医界人士运用,以期一定程度上揭示中药治疗疾病的现代医学机制[12,13,14]。

由本研究网络药理学结果可知,PCC治疗OA的主要活性成分可能是槲皮素,β-谷甾醇,四氢小檗碱,原阿片碱,卡文定碱等。有相关文献报道,槲皮素可以减少促炎性细胞因子的生成、影响炎症相关信号通路、抑制ECM降解,从而保护关节软骨以达到防治OA的目的[15];β-谷甾醇可通过抑制TNF-α的水平,发挥抗炎作用[16],而TNF-α又是导致骨性关节炎的重要炎性介质[17];四氢小檗碱可以减轻前成骨细胞遭受氧化应激带来的损伤,对细胞起到保护作用[18];此外原阿片碱、卡文定碱尚未发现其对骨性关节炎有治疗作用,但有相关文献报道其抗炎作用[19,20]。PCC的活性成分可能通过抗炎、抗氧化来达到治疗骨性关节炎的效果。

由PPI分析发现,PCC治疗OA的核心靶点可能是:IL6、CASP3、MYC、RELA、CCND1等。Laavola等[21]发现,IL6在OA的致病过程中有非常重要的作用;沈金明等[22]在实验研究中证实,膝骨关节炎模型大鼠关节软骨细胞的凋亡水平增高时,Casp3表达亦显著增高,提示软骨细胞凋亡可能通过调节Casp3发挥作用;有相关文献报道,在类风湿关节炎和骨关节炎的病损软骨中c-myc蛋白的表达和原位末端标记的阳性细胞与疾病的程度密切相关[23];Raymond等[24]发现,RElA可以独立于NF-kappaB1或NF-kappaB2来激活IL-1β诱导MMP-1这一基因表达程序来破坏软骨细胞;Ito等[25]通过实验发现,CCND1的过度表达可抑制软骨细胞的成熟。在以上核心靶点中,部分已经被实验证实与OA的关系密切。也有部分实验的数量不足,可作为今后OA的细胞因子层面的机制研究方向。

对GO分析富集结果进行讨论,在重要性排名前5位的生物学过程中分别是:软骨细胞分化的正调控;胚胎下肢形态发生;氧化应激导致的细胞凋亡;核苷酸结合寡聚化结构域信号通路以及酮反应。有文献表明,骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下可分化为软骨细胞[26]。这一原理已被运用于修复OA患者的关节软骨[27]。PCC有可能通过参与这一分化过程来对关节软骨进行修复,从而达到治疗OA的目的。有研究表明,氧化应激过程能产生大量的损伤关节软骨基质、导致关节软骨细胞形态改变的自由基及炎症因子,在OA中发挥着重要的作用[28],而PCC具有抗氧化的成分[18]可以调控这一过程。Simard等[29]研究发现钙结合蛋白S100A8及S100A9蛋白有很大可能性通过活化核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎性小体从而促进膝骨关节炎的发生。其余生物学过程与OA的联系尚缺乏研究支撑,可见PCC治疗OA的生物学过程极为复杂。

对KEGG分析富集结果进行讨论,PCC治疗OA重要性排名前5位的通路分别为:药物代谢、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路以及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路。药物代谢通路:目前尚没有相关文献显示其与OA的联系;流体剪切应力与动脉粥样硬化通路:有文献表明动脉粥样硬化跟骨性关节炎有并不密切的联系[30],尚待更多研究证实;NF-κB信号通路:有研究表明,NF-κB信号通路在软骨细胞的促炎应激反应中的众多通路中处于核心位置[31],其中,促炎细胞因子、趋化因子、应激因子和细胞外基质的降解产物可激活NF-κB蛋白,在刺激之下,NF-κB分子被进一步激活,诱导一系列造成关节软骨破坏的基因表达,导致骨关节炎的发生和发展[32];HIF-1信号通路:有相关研究证实,增加HIF-1α的活性能够诱导热休克蛋白70(HSP70)的过度表达并增强细胞外基质的表达水平,从而防止软骨细胞的凋亡[33];糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路:有相关研究报道并证实,晚期糖基化终末产物(AGE)可以与软骨细胞膜上RAGE结合,对一系列细胞内的信号通路进行激活,进而导致白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13的表达增加,这是晚期糖基化终末产物导致骨关节炎病变的主要途径[34]。

通过构建PPI网络、成分-靶点-疾病关联网络、以及进行GO和KEGG分析,本研究发现黄柏治疗骨性关节炎所调控的关键靶点主要有引发炎症、细胞凋亡的功能,其重要活性成分主要通过抗炎、帮助软骨细胞抗氧化、促进软骨细胞的分化来修补破损的软骨等生物过程,以及通过调节NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路抑制炎性因子的表达来治疗OA产生的炎症以及延缓OA导致的软骨损坏。充分说明黄柏治疗骨性关节炎的机制具有多成分-多靶点-多层次-多通路的特点,其治疗机制可能通过多个生物过程与通路对骨性关节炎引发的炎症反应进行抑制、对关节软骨进行保护以防治疾病。

中医学对OA的治疗探究由来已久。OA一般归入中医学“痹证”“骨痹”范畴,中医一般认为OA的退行性病变以肝肾不足为本。肝主筋,肝亏导致筋脉松弛,肾主骨,肾虚则骨质松软滋生赘物。《珍珠囊》载黄柏有“补肾不足,壮骨髓”之用。然古今以黄柏治骨痹者甚少[35,36,37]。至清朝,《成方便读》治热痹有四妙散一方,以黄柏为君,实取其清热燥湿之用。现代以二仙汤治疗OA者[38,39,40],方中均以黄柏为佐,用于制约方中温阳药物辛温之性。本研究在探究PCC治疗OA的机制中发现,黄柏可能对软骨细胞的分化有正向调节作用,也有不同的生物过程、通路保护关节软骨,颇似“壮骨髓”之功效。四妙散与二仙汤治疗OA时,黄柏的意义与地位值得进一步实验与临床探究。本研究筛选出PCC治疗OA的关键靶点、重要活性成分、主要的生物过程与通路,可为今后中医治疗OA的药理实验和临床组方提供更多有意义的方向与思路。

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