布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌感染引发的一种人畜共患病，不仅威胁人类健康，还带来了巨大的经济影响[1]。布病在世界范围流行，全球每年新发病例约50万[2]。我国新疆的牧区和半牧区地区被列为高度流行区域，其中以羊种布病为主[3]。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，侵入宿主体内的吞噬细胞内繁殖和生存，并依靠特定的免疫逃逸机制不易被机体清除，导致疾病迁延不愈，对患者的损伤更为持久。因此，探索促使布病慢性化的发病机制，寻找能够有效终止布病进程的节点，是目前布病相关的基础研究和临床应用研究亟待解决的难题。

布鲁氏菌感染宿主后，机体调动复杂的免疫系统，包括参与固有免疫和适应性免疫的各种免疫细胞和细胞因子，发挥免疫效应维持或终止布鲁氏菌在宿主机体的生存，干预和影响疾病的走向和最终结局[4]。前期研究发现，布病患者出现了辅助性T细胞17/凋亡性T细胞(Th17细胞/Treg细胞)失衡的现象，表现为Treg相关细胞因子和负性调控因子增多，延缓了布鲁氏菌的清除[5],然而引起这一现象的原因尚不明确。据研究报道，白细胞介素(IL)-33是一种内源性的多功能细胞因子，其表达并储存于细胞核内，当细胞受到损伤或坏死时，可作为炎症预警素被大量释放至细胞外[6]。释放到细胞外后IL-33可通过IL-33/ST2信号途径诱导Th2细胞分化[7],活化Treg细胞、巨噬细胞、固有淋巴样型细胞(ILC2)等免疫细胞发挥调节作用，促进Th2型细胞因子产生[8-9]。据文献报道，IL-33在肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等病程中发挥重要的致病作用，并参与疾病的转归[10-12],然而该因子在布病中的巨大潜能还有待开发。因此本文结合前期研究，对布病患者体内的IL-33和Treg细胞进行检测，进一步通过体外培养试验研究IL-33和FOXP3的调控关系，探讨布病患者出现Treg细胞高表达的原因，寻找新的分子靶点，从而为布病提供新的治疗思路。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2021年1-12月在新疆维吾尔自治区人民医院(以下简称本院)就诊的39例布病患者作为布病组。纳入标准：(1)符合国家卫生行业标准WS 269-2019《布鲁氏菌病诊断》标准，临床表现为发热、骨关节痛、全身乏力等，虎红平板凝集试验(RBPT)进行初筛阳性和试管凝集试验(SAT)检测血清中抗布鲁氏菌特异性抗体，抗体效价≥1∶50,超过6个月仍未痊愈的患者。(2)血培养鉴定出羊种布鲁氏菌的患者。排除标准：有肿瘤、伤寒、风湿热、结核、自身免疫性疾病和其他各种感染等疾病患者。布病组男30例，女9例；年龄(48.77±15.54)岁；流行病学史35例；症状和体征：发热31例，乏力18例，疼痛28例，肝脾肿大8例，淋巴结肿大5例。另选取同期在新疆维吾尔自治区人民医院体检的42例健康对照者作为健康对照组，男32例，女10例；年龄(46.12±13.25)岁；流行病学史42例。两组年龄、性别等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理学委员会批准，所有纳入患者及家属均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器

使用FACS CantoⅡPlus流式细胞仪(Becton, Dickinson and Company,美国)进行流式抗体检测，使用ABI QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR仪(ABI,美国)进行荧光定量PCR(qPCR)检测。

1.2.2试剂

IL-33、ST2检测使用北京旷博生物技术股份有限公司AimPlex流式高通量多因子检测试剂盒(货号：T1C329432)。流式抗体CD3-PerCP(货号：665748)、CD4-FITC(货号：340133)、CD25-APC(货号：666484),CD127-PE(货号：664400),红细胞裂解液(货号：349202)均购自美国BD公司，True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set(货号：424401)和Foxp3-PE(货号：320108)购自美国Biolegengd公司，Ficoll-Paque PLUS购自美国GE公司，RPMI 1640(货号：11875093)和Trizol(货号：15596026)购自Thermo公司。重组人IL-33(货号：abs00829-2ug)购自Absin公司；人IL-33亲和纯化抗体(货号：AF3625-SP)购自美国R&D Systems公司，QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit(货号：2018152)购自德国Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1标本采集

分别采集入选研究对象清晨空腹静脉血2管。一管为乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管，采集6 mL血液直接用于Treg细胞检测和分离外周血单个核细胞(PBMC),于当天检测Treg细胞比例，PBMC提取后加入细胞冻存液于-80℃,次日转入液氮保存；另一管为无添加剂管，采集3 mL血液，分离血清后于-80℃保存，用于IL-33检测。

1.3.2流式细胞术检测Treg细胞表型及比例

取EDTA-K2抗凝血100μL,按说明书规定的剂量分别加入CD4-FITC、CD3-PerCP、CD25-APC、CD127-PE抗体，室温避光孵育15 min,加入溶血素2 mL溶血10 min,离心洗涤后加入500μL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后上机分析，使用FlowJo软件进行数据分析和作图，将CD3+CD4+CD25+CD127low的细胞认为是Treg细胞。

1.3.3 AimPlex法检测IL-33和ST2

取出-80℃下储存的样本进行复溶后，将样本在4℃下以1 2000 r/min离心5 min后吸取上清液，依照说明书步骤进行操作。通过基于AimPlex bead-based免疫测定法测定IL-33、ST2。使用FACS CantoⅡPlus流式细胞仪分析所有样本，通过BD DIVA软件收集数据，利用FCAP Array v3.0软件分析数据。

1.3.4 IL-33刺激和阻断试验

为了明确Treg细胞和IL-33的关系，分别复苏两组PBMC,加入10 mL含15%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃5% CO2培养箱培养3 d,待传代细胞生长稳定后，细胞浓度调整至1×106个/mL,转至24孔培养板中，每孔加500μL培养液体。设立空白对照组(PBS)、刺激组、阻断组。刺激组加入10μL 50 ng/mL的人IL-33干预48 h,阻断组加入10μL 12.5μg/mL的人IL-33亲和纯化抗体干预48 h,空白对照组细胞不做处理。每组设3个重复孔，收集细胞后使用流式细胞分析仪检测CD4 T细胞中的Foxp3比例。

1.3.5 qPCR检测Foxp3 mRNA表达水平

将培养后的细胞加入Trizol冻入-80℃冰箱保存。通过逆转录试剂盒得到的cDNA,利用QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit试剂盒进行扩增。Foxp3正向引物为5′-GTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′,Foxp3反向引物为5′-GGAGCCCTTGTCGGATGATG-3′;β-Actin-F正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,β-Actin反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。热循环条件：95℃预变性2 min, 95℃变性5 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s,共40个循环。采用2-ΔΔCt计算基因相对表达水平。

1.4统计学处理

采用SPSS26.0统计学软件进行分析，GraphPad Prism 8绘制统计图。符合正态分布的计量资料用表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析；计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结 果

2.1两组血清IL-33、ST2水平比较

与健康对照组相比，布病组IL-33、ST2水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。

图1两组血清IL-33、ST2水平比较

2.2两组Treg细胞表型及比例比较

布病组Treg细胞比例(9.20%±1.61%)高于健康对照组(6.41%±1.26%),差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

2.3 IL-33刺激和阻断试验

IL-33刺激后，布病组和健康对照组PBMC中Foxp3比例均比空白对照组显著增加，差异均有统计学意义(P<0.001),Foxp3mRNA表达水平也显著增高，差异均有统计学意义(P<0.001)。与刺激组相比，IL-33阻断组Foxp3比例显著回落，同时Foxp3mRNA表达水平也显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)。与健康对照组相比，布病组在IL-33刺激后比健康对照组具有更高的Foxp3比例，差异有统计学意义(P=0.004)。见图3和表1。

表1Foxp3比例和mRNA表达水平

图2两组外周血Treg细胞比例比较

图3IL-33诱导后各组Foxp3表达变化

3、讨 论

布鲁氏菌感染人体后，能够长时间在机体单核巨噬系统中生存和复制，累及宿主多器官脏器，相对急性期病程而言，布病进展到慢性病程将极度影响患者生存质量，故影响布病慢性进展的因素受到研究者更多地关注。在布病病程中，病原体与宿主的免疫系统之间建立了免疫杀伤、免疫逃逸和免疫耐受等反应，这一系列免疫反应涉及固有免疫和适应性免疫中的多种免疫细胞及细胞因子，其中CD4+T细胞发挥了关键的免疫作用。本课题组前期研究结果显示，Th1细胞可以有效地清除致病菌，而Treg细胞则发挥负向免疫调节功能，产生抑制效应T细胞的杀菌作用[13]。本研究结果发现，布病患者Treg细胞比例与健康对照者相比明显增加，HASANJANI等[14]报道也发现布病患者中存在Treg细胞增多的现象，提升Treg细胞参与了布病的免疫应答。

Foxp3是Treg细胞的转录因子，调控Treg细胞的发育及功能，Foxp3表达的高低变化代表了Treg细胞功能的强弱变化，Foxp3高表达会扭转机体过度的免疫反应[15]。Treg细胞还可以通过释放IL-10、转化生长因子β(TGF-β)等细胞因子发挥免疫抑制功能，避免机体产生过度的免疫反应。本课题且前期的研究也验证了布鲁氏菌感染者血清中TGF-β的水平显著高于健康对照者[5],结合本文发现的Treg细胞比例增加的情况，笔者认为布鲁氏菌感染后机体后，细菌会诱导宿主免疫应答向负向免疫发展，进而延缓宿主对布鲁氏菌的清除，最终导致布病迁延不愈，但是目前引起布病患者Treg细胞比例增加的原因尚不完全明确。

IL-33是炎症因子IL-1家族中的一员，其生物学作用具有多效性，既能作为核因子发挥抑制转录的作用，又能作为可溶性细胞因子调节宿主免疫反应[16-17]。IL-33的特异性配体是转硫酶同系物ST2,主要表达在免疫细胞如Th2、Treg、ILC2等细胞表面。在机体组织和细胞损伤过程中IL-33被释放，并与表达ST2受体的免疫细胞结合，诱导免疫细胞应答，发挥抗炎和保护作用[18-20]。

目前，IL-33在布鲁氏菌感染者中的变化特点鲜有文献报道，本研究结果显示，在布鲁氏菌感染者体内IL-33及其受体ST2表达增高，与健康对照者有差异明显，说明IL-33/ST2在布鲁氏菌感染时发挥了一定的免疫作用。据报道，IL-33是维持机体免疫平衡重要的细胞因子，它可以通过促进ILC2活化，调节Th1/Th2平衡和促进巨噬细胞M2极化等方式调控宿主与病原体之间的免疫平衡[21]。在寄生虫、病毒和细菌等感染性疾病中也均表现为增高[22]。所以推侧IL-33在布病中升高的原因是布鲁氏菌造成了机体的损伤，为了避免损伤扩大上皮细胞或髓系细胞释放IL-33结合免疫细胞上的ST2来应对促炎细胞因子。本课题组前期研究还发现，Treg细胞参与了布病的发生和发展，其负向调控机体过度免疫反应的机制可能是导致布鲁氏菌持续感染的原因[23]。本研究显示，Treg亚群在布病患者体内呈现过表达。为了进一步明确IL-33在布病中发挥作用的靶点，以及IL-33与Treg细胞的关系，本研究进行了体外细胞培养试验，结果发现，不论是健康对照组还是布病组，在IL-33刺激下Foxp3比例和mRNA表达水平与空白对照相比均显著增加，而在IL-33被阻断后，Foxp3比例和mRNA表达水平与刺激组相比均明显回落。本研究还发现，流式细胞术检测Foxp3比例与mRNA表达水平相一致。体外试验证明，IL-33对Foxp3有着直接的调控机制，可以有效地增强Foxp3表达，进而增强Treg细胞的抑制功能。布病患者的PBMC在IL-33刺激后Foxp3比例和mRNA表达水平增加更加明显。这说明IL-33在布病患者体内同样发挥着上调Foxp3的功能。有研究表明，Treg细胞参与了ST2和IL-33的信号传导。LI等[24]发现，ST2参与Treg细胞介导的癌症免疫抑制，同时，缺乏IL-33的Treg细胞以抑制ST2的方式促进肿瘤消退。这表明ST2和IL-33可参与调节Treg细胞在特定部位的功能和作用。WEN等[25]在头颈部鳞状细胞癌中也报道了与本文相似的观点，证实了IL-33与Treg细胞比例呈正相关，通过增加Foxp3+GATA3+Treg细胞的表达进一步增加Treg细胞的抑制功能。上述研究说明，IL-33是导致布病患者Treg细胞增加的重要原因之一，有望成为治疗布病的免疫靶点。本研究仅对IL-33和Treg细胞在布病中的表现和相互关系进行了研究，对于布病患者中IL-33对其他免疫细胞的调控目前尚不清楚，有待进一步深入研究。

综上所述，本研究发现布病患者存在IL-33/ST2和Treg细胞增多的现象，布病患者Treg细胞增多可能是由于IL-33水平升高导致。可见IL-33是在布病发展过程中协调免疫网络系统的关键信号分子，它可以通过Treg表面ST2受体结合来维持组织内稳态，这一免疫机制可以部分解释布病患者难以彻底清除病原菌导致慢性化率高的原因，阻断IL-33有望成为免疫治疗布病的潜在靶点。

参考文献:

[5]卢佩佩,李智伟,王玲玲,等.布鲁氏菌感染患者血清中sPD-1与Th17/Treg细胞因子改变的相关性[J].中国热带医学,2018,18(11):1111-1113.

[10]汤容,黄娟.白细胞介素33及其受体ST2功能性多态位点与宫颈鳞癌的关联分析[J].国际检验医学杂志,2019,40(13):1603-1606.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金杰出青年科学基金项目(2022D01E30);新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2023D01C83,2023D01C84);新疆维吾尔自治区“天山英才”培养计划项目(2022TSYCCX0102);新疆维吾尔自治区科技支疆计划项目(2022E02118);

文章来源:李智伟,早克然·阿力肯,王玲玲,等.IL-33介导Treg细胞功能参与布鲁氏菌病免疫调节机制研究[J].国际检验医学杂志,2024,45(18):2184-2188+2196.