骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常见的原发性恶性 骨肿瘤之一,通常好发于长骨干骺端,如股骨远端､胫 骨近端和肱骨近端等｡OS 易复发与转移,预后不 良[1] ｡骨肉瘤的发病率在地区与时间上差异不大,在 年龄上呈现双峰分布,好发于儿童和青少年,平均年龄 23. 2 岁,占所有骨癌的 20% ~40%[1-2] ｡有研究[3] 报道在 OS 初诊时,15% ~ 20%的患者已经有转移迹象,肺 部转移最为常见｡手术联合新辅助化疗是骨肉瘤的主 要治疗方式,可以在原有基础上显著提高患者的 5 年 生存率以及手术后保肢率,但发生了转移的患者生存 率仍然很低(20% ~ 30%)[4-5] ｡因此,骨肉瘤的转移率 高､生存率低仍是该病的痛点和难点｡

外泌体是直径为40~160 nm 的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),可由多种细胞分泌,包括肿瘤胞,能在大多数体液中找到;外泌体除了维持细胞形 态,也能调节细胞间通讯,其中包含了各种物质,如核 酸､蛋白质､脂质､代谢物等[6] ｡外泌体能通过自分泌､ 旁分泌或随血液循环进行远距分泌等方式调控周围和 靶器官相关细胞的功能并参与骨肉瘤转移前肿瘤微环 境的建立[7] ｡非编码 RNA(non-coding RNA,ncRNA) 是外泌体中重要的调节物之一,在肿瘤微环境及肿瘤 细胞内微环境中发挥多方面的调节作用,其表达水平 的失调常会促进肿瘤的进展与转移[8] ｡

1、NcRNA 简介

NcRNA 是不具备编码蛋白质能力的 RNA｡有研 究[9] 发现,真核生物基因组中不到 2%的基因编码蛋 白产物,而接近 98%的基因不编码相应的蛋白,被认为 是“进化垃圾”｡但在随后的研究中发现 ncRNA 在调 控疾病进展以及生理活动中具有重要的作用,可作为 恶性肿瘤的抑癌或促癌因子｡已证实,ncRNA 可通过 多种途径对肿瘤的进展进行调控,包括 ncRNA 基因本 身的突变､参与 ncRNA 途径中酶的异常变化等遗传途 径,也可通过 ncRNA 的异常表达对表观遗传､转录或 转录后等途径进行调控[9] ｡外泌体 ncRNA 中主要包 括微小 RNA(microRNA,miRNA)､长链非编码 RNA (long non-coding RNA,lncRNA)以及环状 RNA(circular RNA,circRNA)｡miRNA 的作用机制是能与一类特 殊的蛋白质结合形成 RNA 诱导沉默复合物(miRNAinduced silencing complex,miRISC),特异性靶向 RNA 反应元件(miRNA response elements,MREs),从而抑制 蛋白质的翻译过程或降解信使 RNA(messenger RNA, mRNA)调节蛋白质的生成水平;lncRNA 与circRNA 可 作为竞争内源性 RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)海绵化 miRNA,调控下游蛋白质的生成,同时 由于 ceRNA 具有多种 MREs 位点,因此一种 ceRNA 可 以结合多种 miRNA,一种 miRNA 也可以结合多种 ceRNA,这也是骨肉瘤发病机制复杂的原因之一[10] ｡ 在调控肿瘤转移方面,ncRNA 可通过上述的作用机制 诱导上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)､激活相关信号通路提高肿瘤细胞的侵袭和 迁移能力,还能促进肿瘤新生血管的形成并帮助肿瘤 的转移[11] ｡

2、外泌体ncRNA 与骨肉瘤转移

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的提高是骨肉瘤转移的重要条件之一,对骨肉瘤的转移具有关键的作 用[12] ｡有研究[13] 发现癌症相关成纤维细胞(cancerassociated fibroblasts,CAFs)可将上调的 miR-1228 通过 外泌体转入骨肉瘤细胞中,靶向肿瘤细胞侵袭抑制因 子,促进骨肉瘤的侵袭与转移｡此外,也有研究表明外 泌体 ncRNA 的表达水平降低与抑制肿瘤转移有关,例如,在骨肉瘤细胞外泌体中 miR-142-3p[14]与 miR665[15] 的表达水平下调,而 miR-142-3p 和 miR-665 的 过表达都能抑制 OS 细胞的增殖､侵袭与迁移,在体内 外实验中都表现出抑制肿瘤转移的能力｡

2. 1 外泌体 ncRNA 与 EMT

EMT 是上皮细胞表型 发生连接缺失､极性丧失等变化后转化为具有侵袭､迁 移和运动能力的间充质表型的过程,此过程通常会伴 随着上皮标记物(如 E-钙黏蛋白)的下调和间充质标 记物(如波形蛋白､N-钙黏蛋白)的上调,与肿瘤的转 移密切相关[16] ｡LIU W S 等[17]发现骨髓间充质干细 胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)外泌 体中 miR-769-5p 高表达,并负调控双特异性蛋白磷酸 酶 16(dual-specifc phosphatase 16,DUSP16)的表达水 平;OS 细胞与 BMSCs 共培养可显著上调波形蛋白和 N-钙粘蛋白含量,下调 E-钙粘蛋白含量｡同时,在体 内实验中发现 miR-769-5p 模拟组较抑制剂组的肿瘤 肺转移更明显;以上结果表明 miR-769-5/ DUSP16 轴 能诱导 EMT,促进骨肉瘤的进展与转移｡基质金属蛋 白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2 / 7 / 9 属于 EMT 的生物标志物,具有破坏细胞外基质,促进肿瘤转移的 能力,在骨肉瘤中表达常升高[16] ｡最近的一项研究发 现 MMP2 受到 CAFs 外泌体中 lncRNA 核仁小 RNA 宿 主基因(small ucleolar RNA host gene,SNHG)17 的调 控,具体机制为 CAFs 外泌体中 SNHG17 可被递送至骨 肉瘤细胞中海绵化 miR-2861,上调 MMP2 的翻译水 平,促进骨肉瘤细胞的增殖以及迁移[18] ｡外泌体的血 液运输是转移的关键途径之一,在骨肉瘤患者与健康 人血液中某些外泌体 ncRNA 水平处于潜在失调状态, 但其调控转移机制仍不清楚[19] ｡ZHANG H L 等[20] 发 现lncRNA 肿瘤易感候选者(cancer susceptibility candidate,CASC)15 在 OS 患者血浆外泌体中上调,在 OS 组 织和细胞系中具有相同的趋势,且能够通过 miR-338- 3p / Ras 相关蛋白 14 轴调控 EMT 促进骨肉瘤细胞的侵 袭和转移,也展示了其作为潜在生物标志物和治疗靶 点的能力｡上述研究表明外泌体 ncRNA 在调控｡ EMT 以影响骨肉瘤转移中具有十分重要的作用,提示 抑制 EMT 的出现可能是一种潜在的治疗策略｡

2. 2 外泌体 ncRNA 与相关信号通路

Wnt / β-catenin 信号通路:该通路是研究比较充分的经典 Wnt 信号通 路之一｡β-catenin 是该通路的关键信号分子,β-catenin 主要位于细胞膜上,能够与 E-钙粘蛋白结合参与 EMT,也能进入细胞核中发挥其转录调节活性,促进肿 瘤的侵袭和转移[21] ｡ZHU G H 等[22]发现 BMSCs 外 泌体中 lncRNA X 非活性特异性转录本(X-inactive specifc transcript,XIST)可被 OS 细胞内化促进骨肉瘤 的转移和进展,进一步研究发现 XIST 可海绵化 miR655,促进 ATP 柠檬酸裂合酶的表达,使总胆固醇和总 甘油三酯等脂质合成以及总蛋白和核蛋白中 β-catenin 的含量增加,促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移｡在 BMSCs 外泌体中 lncRNA 转移相关肺腺癌转录本 1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)高表达,其可作为 ceRNA 海绵化骨肉瘤细胞 中的 miR-143,上 调 神 经 膜 蛋 白 2 (neurensin-2, NRSN2)以及核蛋白中 β-catenin 的水平;提示 MALAT1 / miR-143 / NRSN2 轴能激活 Wnt / β-catenin 信号通 路,促进骨肉瘤细胞的侵袭､迁移并在动物实验中促进 骨肉瘤的生长[23] ｡

PI3K/ AKT 信号通路:该通路的激活能调节下游 蛋白的表达,如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),也受上游基因的调控,如 抑制基因人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白 同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN),与骨肉瘤的进展和转移 有关[24] ｡在最新的一项研究中发现,肿瘤相关巨噬细 胞(tumor-associated macrophages,TAMs)外泌体中 miRNA let-7a 可负向调控 C15orf41 (chr15q14 ),激活 PI3K/ AKT 信号通路,增强 OS 细胞的侵袭与迁移,促 进 OS 进展[25] ｡SHI Z W 等[26]研究发现 BMSCs 可以 分泌囊泡包裹circNRIP 1 将其携带进入 OS 细胞中,靶 向 miR-532-3p / AKT3 轴,并上调 AKT3 的下游蛋白 pmTOR 的水平,激活 PI3K/ AKT 信号通路,促进 OS 细 胞增殖､侵袭和迁移,从而促进骨肉瘤的进展和转移, 有望成为治疗靶标以及预后标志物｡破骨细胞的过度 活跃在严重的骨破坏和骨转移中发挥重要作用｡LUO T T 等[27] 发现 OS 细胞 EVs 中 miR-19a-3p 水平升高, 激活 PTEN/ PI3K/ AKT 信号通路促进破骨细胞的形成 和骨吸收,并上调 MMP9 和组织蛋白酶 K 的水平｡随 后动物实验发现小鼠血液 EVs 中 miR-19a-3p 高表达, 出现骨质减少且破骨细胞数量增加的现象,与细胞实 验结果一致｡

ERK1 / 2 信号通路:该通路参与了多种疾病的发 生和转移,能调控细胞的增殖､侵袭､迁移和凋亡等多 种生理功能[28] ｡BMSCs 外泌体中 miR-206 除能抑制 EMT 的出现外,也能调节信号通路｡在一项研究[29] 中 发现 miR-206 在骨肉瘤细胞系中低表达,并且与不良 预后相关｡进一步发现 BMSCs 中 miR-206 可经 EVs 进入骨肉瘤细胞中;过表达的 miR-206 可通过靶向抑 制 NRSN2,阻断 ERK1 / 2-Bcl-xL 信号通路进而抑制骨 肉瘤细胞的增殖､侵袭与迁移,在动物模型中可抑制肿 瘤的生长与转移｡然而,在 EVs 中抑制 miR-206 时,部 分逆转了对骨肉瘤细胞的抑制｡提示 miR-206 可能是 骨肉瘤的潜在治疗靶点｡

2. 3 外泌体 ncRNA 与血管生成

由于肿瘤生长迅速,需要消耗大量的氧气与营养物质等,常形成缺氧或 酸性的肿瘤微环境｡为了满足生长的需求,血管的生 成在骨肉瘤进展与转移等方面发挥了关键作用｡有研 究[30] 发现酸性细胞外微环境能促进骨肉瘤细胞释放 含有 miRNA 和蛋白质的 EVs,在调节血管生成中起着 重要作用｡血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是 OS 中最重要的促进血管生成 因子,可激活内皮细胞与其相应的受体结合促进血管 生成,为 OS 细胞的生存和转移提供关键条件[31] ｡ RAIMONDI L 等[32]发现 3 种细胞系(SAOS-2､MG-63 和 U-2OS)外泌体可被人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)摄取,外泌体中 过表达的 miR-21-5p 和 miR-148a-3p 提高了内皮细胞 的活性,促进了 VEGFA､IL-6/ 8 等促血管生成因子的 表达以及管腔的形成,与血管生成密切相关｡在 ZHANG L 等[33] 研究中发现,与正常人相比骨肉瘤患 者血浆外泌体中 miR-199a-5p 下调,HUVECs 能内化该 外泌体并靶向 VEGFA,过表达的 miR-199a-5p 能抑制 HUVECs 的增殖､迁移以及管腔形成,可认为其是肿瘤 抑制因子,是潜在的骨肉瘤诊断生物标志物｡此外,缺 氧状态也与血管的生成相关,可抑制免疫细胞的功能 和诱导肿瘤细胞的转移[34] ｡缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factors-1α,HIF-1α)通常由肿瘤内低氧 微环境诱导,与肿瘤血管生成､侵袭和迁移相关｡YU X 等[35]发现 CAFs 外泌体中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β 可调节骨肉瘤细胞中 lncRNA 牛磺酸上调基因 1 (taurine upregulated gene 1, TUG1)的表达水平,两者呈正相关关系;经证明,两者 在骨肉瘤组织和细胞中均高表达,TUG1 负调控 miR143-5p,进而上调 HIF-1α 的表达水平,促进骨肉瘤的 细胞侵袭与血管生成;由此可见,TGF-β 可调控 TUG1 通过 miR-143-5p / HIF-1α 轴参与 OS 细胞与 CAFs 之间 的相互作用,最后促进 OS 的扩散与转移｡以上研究 表明,血管生成受到多种 ncRNA 和细胞因子的调控, 在促进肿瘤转移中具有重要作用,阻断关键生物分子 的生成或功能可作为潜在抑制肿瘤转移的治疗手段｡

3、外泌体ncRNA 调节化疗耐药

多柔比星(阿霉素)､甲氨蝶呤和顺铂等药物的不同 组合是骨肉瘤化疗的常用治疗方式,然而由于骨肉瘤细 胞具有一定的天然耐药性以及获得性耐药能力,常导致 疗效变差甚至失败[36-37] ｡外泌体 ncRNA 介导耐药可通 过上调药物外排相关蛋白水平进而促进耐药的发生,如 多药耐药蛋白 1(multidrug resistance protein 1,MDR1)和 P-糖蛋白[37] ｡CAI T 等[38]发现 miR-143-3p 在阿霉素 耐药 OS 细胞的外泌体中高表达,其丰度的上调与 OS细胞化疗反应差有关｡PAN Y X 等[39]发现 hsa_circ_ 103801 在 CDDP 耐药 OS 细胞的外泌体中高表达并可 被敏感骨肉瘤细胞内化,提高了耐药相关蛋白(多药耐 药相关蛋白 1 和 P-糖蛋白)的表达水平,抑制骨肉瘤细 胞的凋亡并降低对顺铂的敏感性,促进了耐药的出现｡ 以上研究表明,耐药的骨肉瘤细胞可以通过外泌体将非 耐药细胞诱导为具有抗药性的耐药细胞,可导致疗效及 预后不佳,加速肿瘤的进展｡

4、外泌体ncRNA 作为潜在生物标志物

OS 的诊断方法包括影像学检查以及活检(金标 准),但对于早期的诊断和预后的判断十分困难,因此需 要更加方便､灵敏度和特异性更高的诊断方法[40] ｡外 泌体广泛存在于各种体液中,具有稳定性好､含量丰富､ 易于提取和分离等特点,可作为潜在诊断与预后生物标 志物[8] ｡例如,骨肉瘤患者血清外泌体中 miR-25-3p 高 表达,与患者临床预后呈负相关关系,可作为临床管理 该疾病的潜在新型诊断和治疗工具[41] ｡此外,外泌体 中 miR-199a-5p[33] ､miR-101[42] 以及 linc00852[43] 等也可 作为骨肉瘤转移､诊断和预后的潜在生物标志物｡以上 说明外泌体 ncRNA 有作为潜在生物标志物的能力,但 由于样本量不够､没有标准化的诊断策略等影响因素尚 未应用于临床中,因此需要更加完整和深入的研究来阐 明其在临床中的效用[40] ｡

5、总结与展望

OS 是一种具有高度异质性以及复杂性的恶性骨 肿瘤,与多种机制相关｡外泌体是细胞间通讯的关键 物质,可通过递送囊泡内 ncRNA,调节下游基因表达 水平､调控相关信号通路､影响血管生成与 EMT､诱导 耐药等因素共同促进骨肉瘤的转移与进展｡总之,外 泌体 ncRNA 在骨肉瘤转移与进展中发挥了重要调节 作用,对其深入的研究有助于骨肉瘤的诊断､治疗和预 后,但在骨肉瘤研究中仍然处于初步阶段,如作为骨肉 瘤相关生物标志物的可靠性､转化为潜在分子治疗靶 点的可能性等尚未解决,需进一步研究才能应用于临 床实践中｡

参考文献:

[1]王文剑,于秀淳,韩加,等. 1 593 例骨肉瘤流行病及治疗的回顾性 分析[J]. 中华骨科杂志,2018,38(18):1097-1107.

[11]窦沁怡,王嘉政,杨滢硕,等. 外泌体来源非编码 RNA 在肿瘤微 环境中的作用及临床应用价值[J]. 浙江大学学报(医学版), 2023,52(4):429-438.

[12] 潘寒松,郭昌军,梁一民,等. KLF13 上调对骨肉瘤细胞侵袭､迁 移及 p-AKT 表达的影响[J]. 中华全科医学,2021,19 (12): 2031-2034,2097.

[23]LI F J,CHEN X,SHANG C,et al. Bone marrow mesenchymal stem[24] 勾蓉. 肿瘤干细胞信号通路(PI3K/ AKT)研究与进展[J]. 哈尔滨 医药,2021,41(1):139-141.

[28]葛新滢,邵露露,高雪林,等. 细胞外信号调节激酶 1 / 2 信号通路 调控细胞侵袭性的研究进展[J]. 中国医学科学院学报,2023,45 (1):155-160.

基金资助:国家自然科学基金项目(81960487);

文章来源:胡雪梅,潘宝龙,白萤萤,等.外泌体非编码RNA在骨肉瘤转移中的研究进展[J].中华全科医学,2025,23(01):122-126.