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多发性骨髓瘤特异性蛋白的筛选及初步验证

2025-02-12 94 上传者：管理员

摘要：目的:筛选多发性骨髓瘤(MM)的新型诊断标志或治疗靶点。方法:应用生物信息学方法，基于GEO数据库筛选出Sel1L、SPAG4、KCNN3和PARM1 4个MM高表达分子，采用RT-PCR和Western blot方法检测骨髓瘤细胞系U266、NCI-H929、MM.1s、RPMI8226和白血病细胞系THP1及31例MM患者骨髓单个核细胞中这4种分子的RNA和蛋白表达水平，同时用5例异基因移植健康供者的骨髓标本作对照。结果:与白血病细胞系THP1相比，KCNN3、PARM1、Sel1L在U266、NCI-H929、MM.1s中的表达水平较高，而PARM1在8226中的表达水平更高；Western blot结果显示，这4种基因在4种骨髓瘤细胞系中均有蛋白表达。与健康供者相比，Sel1L、SPAG4、KCNN3和PARM1 mRNA在MM患者中的表达水平更高(均P<0.05);Western blot结果显示，这4种基因在MM患者中均有蛋白表达，且Sel1L、KCNN3水平与健康供者相比差异具有统计学意义(均P<0.01)。结论:Sel1L、SPAG4、KCNN3和PARM1有可能成为MM的诊断标志和治疗靶点。

关键词：
MM
多发性骨髓瘤
生物信息学
血液系统恶性肿瘤
靶点蛋白
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多发性骨髓瘤(MM)是一种来源于浆细胞的血液系统恶性肿瘤,其典型特征是骨髓中存在克隆性浆细胞,这些异常浆细胞生长迅速,可引起多发性溶骨性损害､急性肾损伤､高钙血症和贫血｡MM发病率约占所有癌症的1%,血液恶性肿瘤的10%[1]｡在过去的几十年里,随着蛋白酶体抑制剂､免疫调节药物和单克隆抗体以及自体造血干细胞移植的出现[2],MM的治疗取得了很大进展｡尽管新药和新疗法层出不穷,该疾病仍然被认为不可治愈,且由于骨髓瘤细胞的异质性强,同时存在免疫逃逸和耐药克隆演变等机制,许多患者甚至在接受异基因造血干细胞移植后仍复发[3]｡现有研究显示,免疫检查点抑制治疗在MM中的效果也不如霍奇金淋巴瘤｡研究表明,骨髓瘤细胞的免疫逃逸可能是其难治的原因之一[4]｡基于MM这种难以根治且易耐药复发的疾病特点,目前的治疗方法远无法满足当前的医疗需求,如何改变难治复发MM患者的不良生存现状､改善患者的生存质量仍是亟待解决的难题[5]｡通过抗体直接靶向肿瘤细胞表面抗原的免疫疗法[6],或通过细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)靶向骨髓瘤细胞内特异性抗原,本课题组前期研究已经证实的通过CTL靶向AKAP4可在体外和体内都表现出显著的抗骨髓瘤活性[7],这些治疗方法都已成为MM治疗的快速发展领域,而开发特异靶向MM药物的前提和基础,就是筛选出恶性克隆性浆细胞特异性表达的靶点蛋白｡

本研究利用生物信息学方法从Hemap网站中筛选出与骨髓瘤相关的一系列基因,在骨髓瘤细胞系和原代细胞中对这几个基因进行RNA水平和蛋白水平的验证,确认其成为MM治疗靶点的可能性,以期为后续的研究提供实验基础｡

一、材料与方法

细胞系与病例

骨髓瘤细胞系U266､MM.1s购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,RPMI8226､NCIH929和白血病细胞系THP1均为本实验室所保存;患者骨髓血来自2022年7至12月在北京大学第一医院血液科确诊的31例MM患者,异基因移植健康供者5例,所有患者临床诊断均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2022年修订)》[8]｡本研究已获得医院伦理委员会批准,所有患者均已签订知情同意书｡

试剂与仪器

RPMI1640基础培养基和FBS血清均购自美国Gibco公司;PVDF膜和ECL发光液均购自美国Millipore公司;兔抗人Sel1L抗体､兔抗人GAPDH单克隆抗体购自英国Abcam公司;兔抗人KCNN3抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司;鼠抗人SPAG4抗体购自美国SantaCruz公司;兔抗人PARM1抗体购自英国Biorbyt公司｡二氧化碳细胞培养箱购自美国ThermoFisher公司;酶标仪购自美国Bio-Rad公司｡

标本的处理

留取患者骨髓血标本,向其中倒入两倍于样本体积的淋巴细胞分离液,将离心后得到的中部灰白色的白膜层吸取到新的15ml离心管中,PBS洗一遍｡如沉淀物表面附有红细胞,加入1×红细胞裂解液,直至得到干净的骨髓单个核细胞沉淀物｡将沉淀物分为两部分,一部分提取RNA,另一部分提取蛋白｡

RT-PCR检测基因mRNA水平

沉淀物加入1mlTRIzol试剂,冰上静置10min,使样品充分裂解｡加入200μl氯仿,混合均匀,室温静置5min｡离心15min,吸取上层澄清液体约300μl于新EP管中,加入300μl异丙醇,充分混合均匀后室温静置5min｡离心10min,加入1ml的75%乙醇,充分混合均匀,室温下静置5min｡离心10min后弃上清,静置,干燥RNA沉淀后,加DEPC水稀释测浓度,逆转录形成cDNA进行PCR检测｡逆转录上下游引物序列见表1｡

Westernblot检测基因蛋白水平

对细胞系或人PBMC进行全蛋白裂解,对得到的蛋白裂解液进行浓度测定,根据测定结果将蛋白样本定量至合适的浓度｡按照蛋白上样量50μg吸取适宜体积的蛋白样品,经过电泳和转膜,将蛋白转移到PVDF膜上,5%的牛奶封闭1h,按照Marker所指示的条带对PVDF膜裁剪｡用稀释好的一抗(1∶1000)孵育相应的膜,抗体使用量大约2ml,覆盖住膜即可｡一抗过夜孵育后,于第2天洗膜后孵育二抗(1∶1000)1h,后TBST洗膜3次发光｡

统计学分析

采用SPSS25.0统计软件对数据进行分析,非正态分布资料两组间比较采用Mann-WhitneyU检验,P<0.05为差异有统计学意义｡

二、结果

关键基因筛选

基于GEO数据库筛选出Sel1L､SPAG4､KCNN3､PARM14个MM高表达分子,在Hemap网站上找到这4个分子,根据检索结果,如图1所示,KCNN3､PARM1､Sel1L和SPAG4在骨髓瘤细胞上的表达均高于其在红系､髓系､B淋巴细胞及T淋巴细胞表面上的表达,因此,选择这4个分子进行特异性蛋白的验证｡

骨髓瘤细胞系中Sel1L､SPAG4､KCNN3和PARM1的表达

通过RT-PCR和Westernblot法检测骨髓瘤细胞系U266､NCI-H929､MM.1s､RPMI8226及白血病细胞系THP1中Sel1L､SPAG4､KCNN3和PARM1的表达,结果显示,与白血病细胞系THP1相比,KCNN3､PARM1､Sel1L在U266､NCI-H929､MM.1s中的表达水平较高,而PARM1在8226中的表达水平更高(图2),蛋白水平检测结果显示,这4种基因在4种骨髓瘤细胞系中均有表达(图3)｡

骨髓瘤原代细胞中Sel1L､SPAG4､KCNN3和PARM1的表达

PCR检测31例MM患者和5例骨髓移植健康供者骨髓单个核细胞中Sel1L､SPAG4､KCNN3和PARM1的表达,结果显示,与健康供者相比,这4种基因的mRNA表达水平在骨髓瘤患者中更高,比较差异具有统计学意义(均P<0.05)(图4)｡Westernblot结果显示,KCNN3､PARM1､Sel1L和SPAG4均在骨髓瘤原代细胞中有不同程度的表达,且Sel1L､KCNN3水平与健康供者相比差异具有统计学意义(均P<0.01)(图5)｡

三、讨论

骨髓瘤免疫疗法的兴起为广大癌症患者带来了新的希望,这其中包括MM治疗近些年来发展最快速的领域———通过抗体靶向肿瘤细胞表面抗原或通过CTL靶向细胞内抗原[9]｡特异性靶点蛋白的筛选是开发靶向药物的前提和基础｡MM的靶点如CD38､CD138､SLAMF7､FcRH5､BCMA和GPRC5D等特异性表达在恶性浆细胞表面,靶向这些分子的单抗､双抗或抗原嵌合受体T细胞已上市或在临床试验中｡细胞内抗原目前尚无法通过常规抗体来靶向,但靶向NY-ESO-1的TCR-T已经证实对部分骨髓瘤患者有效[10]｡

本研究通过生信分析筛选出4个在骨髓瘤中高表达的基因,然后分别在骨髓瘤细胞系和原代MM细胞中验证了mRNA和蛋白的表达,从而初步认为,这些基因尤其是其中的Sel1L和KCNN3可能成为骨髓瘤治疗的靶点｡既往对这4个基因的研究表明,PARM1的高表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的不良预后相关[11];SPAG4的表达与患有结肠腺癌､结肠癌､骨肉瘤的患者表现出一定程度的相关性[12-13],并且参与了肝细胞癌､肾细胞癌､肺癌､胶质母细胞瘤的发生发展过程[14-17];KCNN3在卵巢癌､胰腺癌中被证实可能成为潜在治疗靶点和预后标志物[18];Sel1L在进化中高度保守,大多数研究都集中于其在癌症进展中的作用[19],也有研究发现过表达Sel1L与肿瘤侵袭性降低相关[20]｡

4种基因的蛋白表达的组织定位不同,KCNN3､SPAG4和PARM1均在细胞膜有不同程度的表达[21-23],后续可考虑应用抗体来靶向;而Sel1L则主要表达在内质网[24],后续可能需要通过CTL或小分子化合物来调控｡本研究Westernblot所用样本为骨髓瘤患者骨髓液,没有经过CD138富集,因此,所得阳性率可能存在一定的假阴性｡这4个蛋白目前均没有可用于流式细胞学检测的抗体,后续拟检测CD138抗体标记磁珠富集后样本,或通过免疫荧光染色检测患者的骨髓涂片标本,可能提高阳性率｡

综上所述,本研究在MM细胞系和原代细胞中初步验证了KCNN3､SPAG4､Sel1L和PARM1的表达,提示这4种分子有可能成为骨髓瘤治疗靶点｡但由于总体病例样本数量较少,同时样本没有经过磁珠富集,所得结果尚需进一步实验验证｡

参考文献:

8中国医师协会血液科医师分会,中华医学会血液学分会.中国多发性骨髓瘤诊治指南(2022年修订).中华内科杂志,2022,61(5):480-487

基金资助:北京大学第一医院科研“希望之星”专项(2022XW03);

文章来源:赵珊,刘绘绘,杨晓颖,等.多发性骨髓瘤特异性蛋白的筛选及初步验证[J].中国实验血液学杂志,2025,33(01):127-132.