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流式检测骨髓正常浆细胞在多发性骨髓瘤疗效评估中的价值

2020-10-06 1609 上传者：管理员

摘要：目的:探讨流式检测骨髓正常浆细胞在多发性骨髓瘤治疗后监测中的价值。方法:回顾性分析2016—2019年218例多发性骨髓瘤患者治疗后,骨髓形态学及流式复查结果,其中包括化疗后复查194例、自体干移植后复查19例、CAR-T后复查5例;以形态学浆细胞比例是否<5%将所有复查结果分为完全缓解(CR)组及未达CR组,同时,依据流式检测中有无检出异常或正常浆细胞,将所有复查结果分为检出异常浆细胞组、检出正常浆细胞组、未检出正常浆细胞组、同时检出异常及正常浆细胞组;分析各组形态学浆细胞比例、流式异常正常浆细胞比例、异常/正常浆细胞比值,以及同期血清免疫固相电泳、免疫球蛋白、β2微球蛋白的关系。结果:218例复查结果中,形态学CR组126例,未达CR组92例,形态学CR组结果中,流式检出正常浆细胞例数显著高于未达CR组(P<0.05)。218例流式分组结果,检出异常浆细胞组共178例,异常浆细胞比例与形态学浆细胞比例呈高度正相关(r=0.873),但流式比例明显低于形态学比例(P<0.05);检出正常浆细胞组共129例,其流式及形态浆细胞比例、免疫球蛋白、β2微球蛋白均显著低于未检出正常浆细胞组(P<0.05)、血清免疫固相电泳转阴例数显著高于未检出组(P<0.05);同时检出异常及正常浆细胞组共89例,其异常/正常浆细胞比值与流式异常浆细胞比例、骨髓形态学比例均呈高度正相关(r=0.848、0.619)。结论:多发性骨髓瘤患者骨髓复查中出现正常浆细胞是肿瘤负荷下降的标志,异常/正常浆细胞比值在疗效评估有一定的价值,建议流式报告中常规描述。

关键词：
免疫球蛋白
多发性骨髓瘤
正常浆细胞
流式细胞术
骨肿瘤
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多发性骨髓瘤是恶性浆细胞克隆性疾病,是血液系统常见的恶性肿瘤,参考2016年国际骨髓瘤工作组标准[1],MM疗效评判可分为传统标准和微小残留标准,传统标准中的肿瘤检测下限是基于形态学浆细胞<5%的完全缓解(CR)、及CR基础上更严格的免疫学缓解SCR,CR的肿瘤检测敏感性为10-2,SCR约在10-3,而MRD疗效标准的检测深度则要远胜于传统标准,可达10-6～10-4[2]。随着新技术的发展,越来越多的检测方法被应用到MM疗效评估中,但达到CR或SCR标准而MRD仍然阳性的患者肿瘤负荷如何评估,概念比较模糊。

流式细胞术是一种荧光免疫技术,8～10色方案的二代流式技术,具有快速、灵敏度高、易于标准化及适用性广等优点,已广泛应用于MM的诊断及MRD的检测[3,4],尤其FCM在MM-MRD中的应用更是近几年国内外的研究热点[5,6]。

值得一提的是,流式检测浆细胞肿瘤是在细胞水平上进行的,检测中除了分析浆细胞肿瘤外,还可兼顾提供其他每一个有核细胞的参数,如淋巴细胞、正常浆细胞等[7]。本研究回顾性分析2016-2019年确诊的56例MM患者的复查结果,通过比较流式检测中出现正常浆细胞与未出现正常浆细胞组的差异,以及正常浆细胞、异常浆细胞比值与形态学浆细胞比例、免疫固相电泳等结果的关系,以期为MM患者疗效评估提供有价值的信息。

1、资料与方法

1.1研究对象

2016-2019年我院确诊的56例MM患者,经化疗、移植、免疫治疗后,复查骨髓评估患者肿瘤负荷,每次复查均检测形态学常规及流式,共218例复查结果,其中包括化疗后复查194例、自体干移植后复查19例、CAR-T后复查5例。

1.2仪器与试剂

多参数流式细胞仪:NAVIOS(美国BeckmanCoulter)。所有流式抗体及破膜剂均来自美国BeckmanCoulter公司,抗体克隆号如下:CD38(T16)、CD138(B-A38)、CD56(N901)、CD19(J3.119)、Kappa(Polyclonal)、Lambda(Polyclonal)、CD45(J.33)、CD117(95C3),破膜剂:PerFix-nc。

1.3方法

流式检测采用8色方案,骨髓穿刺术吸取2～4mL骨髓液,肝素抗凝,标本采集后24h内进行检测。先用CD45-KO,CD38-ECD,CD138-APC,CD56-PC5.5,CD117-PC7,CD19-PB标记胞膜15min后破膜,再用Kappa-FITC,Lambda-PE标记细胞质,最后离心重悬上机检测,同型对照采用鼠抗人免疫球蛋白IgG1,收集30～50万个细胞。

流式结果分析,首先用CD38/CD138设门圈出浆细胞,分析设门中浆细胞CD19,CD45,CD56,CD117的表达情况及各亚群细胞质Kappa、Lambda的表达情况,正常浆细胞表达CD19、连续表达CD45、部分弱表达CD56、不表达CD117,细胞质轻链部分表达Kappa、部分表达Lambda,将表型出现异常同时细胞质轻链限制性表达的浆细胞群定义为异常浆细胞,定义的每个细胞群不少于30个细胞,浆细胞肿瘤细胞检出敏感性10-4,未检测到异常浆细胞的标本认为在10-4水平流式MRD阴性。

骨髓涂片经瑞特姬萨姆染色,经验丰富的形态学医生显微镜下观察骨髓增生程度并计数200个有核细胞,以进行细致的观察与分类描述。

数据分组,根据所有复查结果,将骨髓形态学浆细胞比例<5%的设为CR组,浆细胞比例≥5%设为未达到CR组;同时依据流式检测中有无检出异常或正常浆细胞,将所有复查结果分为检出异常浆细胞组、检出正常浆细胞组、未检出正常浆细胞组、同时检出异常及正常浆细胞组。

1.4统计学处理

应用SPSS17.0统计软件进行分析,计量数据用x¯±s表示,组间比较采用成组t检验,相关性采用Pearson相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

218例复查结果中,满足形态学浆细胞<5%标准的CR组共126例,未达到CR组92例;流式检测结果中,检出异常浆细胞组178例,在10-4的水平上流式MRD阴性40例;流式检出正常浆细胞组129例,未检出正常浆细胞组89例;同时检出异常及正常浆细胞组89例。见表1。

流式检出异常浆细胞组共178例,异常浆细胞比例与形态学浆细胞比例呈高度正相关(r=0.873),线性方程Y=1.327X+5.111,但流式比例显著低于形态学比例(P<0.05);流式比例与免疫球蛋白及β2微球蛋白相关性弱,分别为(r=0.372、0.311),线性方程Y=0.511X+29.454、Y=0.106X+4.442,形态学比例与两者相关性略高于流式,分别为(r=0.451、0.346),线性方程Y=0.364X+27.925、Y=0.066X+4.412。

流式检出正常浆细胞组共129例,未检出正常浆细胞组89例,正常浆细胞检出组流式及形态学浆细胞比例、免疫球蛋白、β2微球蛋白均显著低于未检出组(P<0.05),见图1。血清免疫固相电泳转阴46例显著高于未检出组5例(P<0.05)。

同时检出异常及正常浆细胞组共89例,异常/正常浆细胞比值与流式异常浆细胞比例、骨髓形态学比例均呈高度正相关(r=0.848、0.619),线性方程Y=4.049X+1.679、Y=1.272X+1.152,与免疫球蛋白、β2微球蛋白无相关性。

形态学CR组126例,其中113例流式检出正常浆细胞,显著高于未达到CR组的16例;CR组浆细胞形态与流式比例呈正相关(r=0.630),线性方程Y=0.864X+1.933,相关性低于未CR组(r=0.816),线性方程Y=1.551X+11.117。

病例分析:患者,男,56岁,2018年6月我院确诊多发性骨髓瘤,3次诱导治疗后行自体造血干细胞移植,包括初诊共进行5次骨髓穿刺,骨髓涂片形态学比例依次为72%、28%、1%、1%、1%。流式检测首先通过CD38/CD138设门圈出浆细胞,然后分析设门细胞CD19、CD45、CD56、CD117及各亚群胞浆Kappa、Lambda的表达情况,报告异常浆细胞比例、正常浆细胞比例、异常/正常浆细胞比值见图2;5次流式结果分别为异常浆细胞46.79%,异常浆细胞16.39%,异常浆细胞0.76%、正常浆细胞0.18%、异常/正常4.2,异常浆细胞0.13%、正常浆细胞0.26%、异常/正常0.5,正常浆细胞0.36%,见图3。5次结果流式检测异常浆细胞与形态学比例呈正相关,但比例均低于形态学;检出正常浆细胞的3次形态学复查结果均CR,但3次形态学比例无差异,均为1%;异常/正常浆细胞比值与异常浆细胞比例呈正相关。

表1218例MM复查结果分组

图1正常浆细胞检出组与未检出组肿瘤负荷指标比较

图2流式检测异常及正常浆细胞的分析方法

a:CD38/CD138圈出浆细胞;b:根据浆细胞膜表面各标记分群;c:表型正常的亚群无胞浆轻链限制性表达,定义为正常浆细胞;d:表型异常的亚群胞浆轻链限制性表达,定义为异常浆细胞。

图35次骨髓复查流式检测结果

流式散点图显示,随着诱导治疗到自体干细胞移植,复查结果从出现正常浆细胞、异常/正常浆细胞比值下降、到未检出异常浆细胞流式MRD阴性,肿瘤负荷降低,提示治疗效果显著。

3、讨论

骨髓涂片形态学是MM最常用的疗效评估手段,能较好的反映机体肿瘤负荷,但形态学敏感性低,一般只计数200个细胞,检测深度10-2,同时,CR后,仅依靠形态学很难准确判断涂片中偶见的浆细胞是残留肿瘤细胞,还是骨髓重建后的正常细胞,本文结果中CR组形态与流式浆细胞比例的相关性明显低于未达到CR组,也与理论相符。免疫球蛋白、β2微球蛋白在评价预后上都有一定作用,但受肿瘤异质性影响大[8],与形态及流式浆细胞比例相关性都弱,且相关性主要体现在肿瘤高负荷时,在疗效评估中价值有限。

研究还发现流式检测的异常浆细胞比例明显低于形态学比例,可能原因有:①骨髓瘤细胞易粘连纤维化,穿刺获取标本时会阻碍细胞抽吸,且在大多数医院,第一部分的骨髓常被用于涂片,只有第二部分甚至第三部分的骨髓才被用于流式细胞计数,导致样本被血液严重稀释[9];②骨髓瘤细胞较脆弱,在与骨髓基质分离后很快就开始死亡[10],同时流式的前处理也会破坏部分肿瘤细胞。因此,若直接采用流式异常浆细胞比例评估机体肿瘤负荷,会导致结果偏低,可能误导临床。

浆细胞作为B细胞的效应细胞,是骨髓的正常组成成分,但当MM患者肿瘤细胞恶性增殖时,正常浆细胞的生长就会被抑制,回顾性分析中发现,流式结果中检出正常浆细胞的复查组,反映肿瘤负荷的指标均显著低于未检出组,提示骨髓中出现正常浆细胞是机体肿瘤负荷下降的一个标志;同时,89例患者同时检出异常及正常浆细胞的复查组中有73例为CR患者,且异常/正常浆细胞比值与流式异常浆细胞比例、骨髓形态学比例均呈高度正相关,提示异常/正常浆细胞比值可作为评估机体肿瘤负荷的一个参数帮助疗效判断,尤其在MM患者达到CR后。

总的来说,MM的疗效评估虽然技术方法众多,但仍存在各种缺陷,尤其在肿瘤负荷低但MRD仍未阴性的阶段,本研究认为流式检测正常浆细胞在其中具有一定意义,可作为治疗后评估的一个参数,建议复查报告中常规描述,但具体应用及评价标准仍需要进一步探索。

参考文献:

[5]中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组.多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(2017年版)[J].中华血液学杂志,2017,38(12):1001-1011.

金鑫,陆玲娜,周梦,周雯霏.流式检测骨髓正常浆细胞在多发性骨髓瘤疗效评估中的价值[J].临床血液学杂志(输血与检验),2020,33(05):678-681.

基金:浙江省医药卫生科技计划面上项目(No:2019KY048).