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白消安抑制多发性骨髓瘤细胞恶性生物学特性的分子机制

2023-10-09 62 上传者：管理员

摘要：探讨白消安对多发性骨髓瘤细胞恶性生物学特性的影响，并探索其分子机制。方法:予不同浓度梯度白消安干预多发性骨髓瘤RPMI8226细胞，MTT法检测细胞增殖活力，Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况，实时荧光定量PCR技术检测凋亡调控分子Bax、Bcl-2及Wnt3a/β-catenin通路信号分子mRNA的表达情况，Western blot技术检测Bax、Bcl-2及Wnt3a/β-catenin通路蛋白的表达改变。结果:白消安可明显抑制骨髓瘤RPMI8226细胞细胞增殖活性，并诱导其凋亡(P<0.05)。予不同浓度白消安干预细胞48 h后，可使抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低，并上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时抑制Wnt3a/β-catenin信号通路激活以诱导RPMI8226细胞发生程序性死亡(P<0.05)。结论:白消安可抑制骨髓瘤RPMI8226细胞恶性生物学特性，其作用机制可能与调控Bcl-2家族蛋白表达及抑制Wnt3a/β-catenin信号通路激活有关。

关键词：
分子机制
多发性骨髓瘤
恶性生物学特性
白消安
血液系统恶性肿瘤
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多发性骨髓瘤(MM)是源于B细胞的恶性克隆性浆细胞肿瘤，其为中老年男性最常见的血液系统恶性肿瘤，具有高度异质性、难治性[1]。多发性骨髓瘤特点主要为恶性浆细胞无限克隆性增殖，可造成多器官系统损害[2]。尽管血液学领域对于MM治疗手段几经改良，在一定程度上改善了MM患者预后，但由于MM疾病本身的特殊性，临床复发、难治以及耐药十分常见，致使MM患者的临床疗效及预后差、远期生存率低，因此积极寻求有效的治疗手段具有重要的现实意义[3]。白消安(Busulfan)作为一种双甲基磺酸酯类烷化剂，可选择性地作用于造血系统粒系，其常与针对成熟淋巴细胞有细胞毒性作用的化疗药物联用，是临床经典的抗肿瘤及骨髓造血干细胞移植预处理药物[4,5]。本研究通过体外实验使用白消安干预MM细胞株RPMI8226细胞，探讨白消安对骨髓瘤细胞增殖、凋亡、周期等恶性生物学行为的影响及其作用机制，旨在为MM的临床诊疗与基础研究提供实验依据与理论参考。

1、材料和方法

试剂与仪器

胎牛血清、RPMI 1640培养基均购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素双抗购于上海碧云天生物公司；白消安购于美国Sigma公司；TRIzol试剂购于上海Invitrogen公司；MTT检测试剂盒购于上海吉凯科技公司；逆转录试剂盒购于日本TaKaRa公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于南京凯基生物公司；BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；GAPDH抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、Wnt3a抗体、β-catenin抗体购于美国Abcam公司；凝胶成像仪、电泳仪和酶标仪购于美国Bio-Rad公司；-80℃冰箱、CO2培养箱均购于日本Sanyo公司；高速离心机、移液枪、微量加样器均购于德国Eppondoff公司；流式细胞仪购于美国BD公司。

细胞株与细胞培养

人骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所。将RPMI8226细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中孵育，每2-3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

MTT法检测细胞增殖活力

取对数生长期的RPMI8226细胞，以每孔4×105接种于96孔板中，置于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养24、48和72 h,设置对照组和低、中及高剂量白消安组，每个浓度设3个复孔。其中，低、中、高剂量组分别加入白消安25、50和100 μmol/L,对照组加入0.1% DMSO培养液。严格按MTT试剂盒说明书进行实验，将浓度为5 mg/L的20 μl MTT溶液加入各孔中继续培养4 h,弃上清液，加入DMSO 150 μl,置于摇床室温避光振荡10 min,采用酶标仪测定570 nm处吸光度(A)值，细胞增殖能力以细胞增殖率表示。细胞存活率=[(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%。

Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞浓度至1×105个/孔接种于6孔板，分别使用低、中、高剂量白消安25、50和100 μmol/L干预细胞，在5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养48 h,收集细胞液，离心3 min,将培养基弃去，以PBS溶液清洗3次，细胞置于混悬液500 μl中，加入5-10 μl的PI溶液和Annexin V-FITC溶液中，吹打均匀后，将其置于冰上、避光条件下反应10 min,于60 min内采用流式细胞仪测定，重复3次。

qRT-PCR技术检测基因表达改变情况

取对数生长期RPMI8226细胞予低、中、高剂量25、50和100 μmol/L白消安干预，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，利用TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,检测浓度和纯度后按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA,应用ABI 7500型荧光定量PCR仪和SYBR GreenMaster(ROX)试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参照，引物序列详见表1。总反应体系20 μl,包括：2 μl cDNA,10 μl SYBR Green(ROX),上、下游引物各0.5 μl, RNase-free ddH2O 7 μl;反应条件为：第一阶段(预变性):50℃ 2 min、95℃ 10 min, 1个循环；第二阶段：95℃ 15 s(变性)、60℃ 1 min(退火/延伸),共40个循环；第三阶段(溶解曲线分析):95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 30 s、60℃ 15 s,1个循环；采用Ct值比较法予qRT-PCR结果分析，并对比Bcl-2、Bax、Wnt3a、β-catenin mRNA表达水平，即ΔCt=Ct值目的基因-Ct值GAPDH,采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CTGADPH)实验组-(CT目的基因-CTGADPH)对照组。

Western blot检测凋亡蛋白与信号通路表达

取对数生长期RPMI8226细胞予低、中、高剂量白消安25、50和100μmol/L干预，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，使用全细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并利用BSA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。使用等量蛋白予SDS-PAGE电泳，后将其转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h,使用ECL化学发光试剂盒处理PVDF膜，在成像系统下曝光成像。

统计学分析

各实验均重复3次，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。本研究所有数据均以Mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。用GraphPad Prism7软件制图。 P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

白消安对RPMI8226细胞增殖活性的影响

如图1所示，予低、中、高剂量白消安25、50和100 μmol/L干预RPMI 8226细胞24、48和72 h后，细胞增殖活性随白消安浓度增加而逐渐减低，呈剂量和时间依赖关系(r=-0.821, r=-0.798)。

白消安对RPMI8226细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组相比，予低、中、高剂量(25、50和100μmol/L)白消安干预RPMI 8226细胞48 h后，细胞凋亡率呈剂量依赖增强(r=0.895)。

白消安对凋亡及信号通路分子mRNA表达的影响

如图3所示，予低、中、高剂量白消安25、50和100 μmol/L干预RPMI8226细胞48 h后，可明显下调抗凋亡分子Bcl-2的表达及Wnt3a/β-catenin信号通路分子mRNA的表达，并上调促凋亡分子Bax的表达，以诱导细胞发生程序性死亡，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。

白消安对RPMI8226细胞凋亡蛋白的影响

与对照组相比，予低、中、高剂量白消安25、50和100μmol/L干预RPMI8226细胞48 h后，可明显下调抗凋亡分子Bcl-2的表达(P<0.05,P<0.01),并明显上调促凋亡分子Bax的表达(P<0.01)(图4),且上述结果与qRT-PCR结果一致。

白消安对RPMI8226细胞信号通路蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组相比，予低、中、高剂量白消安25、50和100 μmol/L干预RPMI8226细胞48 h后，可显著下调Wnt3a/β-catenin通路信号分子蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),从而抑制Wnt3a/β-catenin信号通路的激活，且上述结果亦与qRT-PCR结果一致。

3、讨论

MM作为一种恶性浆细胞无限增殖性肿瘤，其发病率呈逐年不断上升、年轻化趋势，是严重威胁国人生命健康的重大恶性血液病[6]。MM不仅在淋巴造血系统增殖浸润、侵袭骨髓，同时亦可损伤免疫系统及骨骼系统，还可导致心、脑、肾等实质器官损伤，进而造成多器官功能障碍，是目前尚无法治愈的血液系统恶性肿瘤[7,8]。随着免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂以及自体造血干细胞移植等治疗手段的临床应用，在一定程度上提高了MM患者疗效，但其预后仍不容乐观[9]。为此，积极寻找安全有效的联合治疗方案显得尤为必要。

众所周知，由于血液系统肿瘤常出现化疗抗性与耐药，复发、难治尤为普遍，外周血造血干细胞移植成为恶性血液病关键且有效治疗方案之一[10]。通常，造血干细胞移植的预处理方案是在尽可能减少药物相关毒性基础上，清除残余血液肿瘤细胞及其恶性克隆。其中，环磷酰胺联合白消安作为血液学领域中成熟的异基因造血干细胞移植预处理方案，已应用于临床数十载[11,12]。然而，白消安作为一种常用的烷化剂类细胞毒性药物，其在抗MM中更深入的分子生物学机制尚未完全阐明，进一步探讨白消安对MM恶性生物学特性的影响机制，将有助于为临床抗MM治疗提供借鉴与参考，同时有望筛选MM的新型治疗靶点。

本研究通过利用白消安体外干预MM细胞株RPMI8226细胞，探究其是否对骨髓瘤细胞存在增殖抑制及促进凋亡的作用。结果发现，白消安可抑制RPMI8226细胞增殖活性并诱导其凋亡，其对RPMI8226细胞增殖抑制率呈剂量-时间依赖性，通过流式细胞术检测亦证实上述效应的存在。由于抑制肿瘤增殖并诱导其凋亡是临床抗肿瘤药物的共通机理，而B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族是学术界公认的凋亡程序调控者，其也是由凋亡逃逸方式介导的肿瘤发生、进展及化疗抗性与耐药性形成的介导者[13,14]。Bcl-2家族被分为抗凋亡与促凋亡蛋白成员，两者联合作用调控肿瘤细胞的凋亡程序过程[15]。为了深入探究白消安诱导骨髓瘤细胞凋亡的分子机制，本研究通过qRT-PCR技术以及蛋白免疫印迹实验均证实，白消安可通过上调促凋亡蛋白Bax的表达并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达以诱导RPMI 8226细胞程序性死亡，从而发挥抗骨髓瘤作用。

Wnt是一类分泌型糖蛋白，其可与细胞表面特异性受体互相作用，通过一系列下游蛋白的磷酸化和去磷酸化过程引起β-catenin积累，并通过β-catenin激活基因转录，而β-catenin是一种多元效应性蛋白，调控各式基因表达，其异常表达或激活可引起肿瘤的发生、发展[16,17]。然而，Wnt/β-catenin信号转导通路是生物进化中极为保守的通路，当胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合后，β-catenin在胞质中累积，并向细胞核转移，进而激活cyclinD1、c-myc等原癌基因，从而导致细胞的增殖、分化等[18,19]。目前已有研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在多种恶性肿瘤的发生、发展中被异常激活[20,21,22]。本研究通过低、中、高剂量白消安干预MM细胞株RPMI8226细胞后，结果显示，白消安可明显下调Wnt3a/β-catenin信号通路mRNA和蛋白的表达，从而诱导骨髓瘤细胞程序性死亡。

综上，本研究结果表明，白消安可抑制骨髓瘤RPMI8226细胞恶性生物学特性，其分子机制可能与调控Bcl-2家族蛋白表达以及抑制Wnt3a/β-catenin信号通路激活有关。由于MM病因机制学复杂，是中老年常见的血液系统恶性肿瘤，其通常疗效欠佳且预后差，化疗耐药是MM治疗失败、复发难治的主要挑战。为此，本课题后续将积极探索白消安单药或联合其他化学药物对MM恶性生物学特性的影响以及逆转耐药的作用机制，以期为抗骨髓瘤基础与临床研究奠定实验基础。

参考文献:

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[2] 严志民,刘彦权,黄走方,等.T细胞亚群与细胞因子水平变化在多发性骨髓瘤患者临床诊疗及预后评估中的价值.中国实验血液学杂志,2022,30(6):1791-1796.

[3] 李其辉,刘彦,王晶,等.新药时代早期复发对新诊断多发性骨髓瘤患者预后的影响及其危险因素分析.中国实验血液学杂志,2023,31(1):148-153.

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[6] 刘小琴,熊园林,马遥,等.BECN1表达对人骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖､侵袭的影响.中国实验血液学杂志,2022,30(5):1469-1473.

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[8] 史玉叶,侯强,陶红,等.CXCR4在多发性骨髓瘤中对卡菲佐米疗效及预后的影响.中国实验血液学杂志,2022,30(2):455-460.

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文章来源:黄涛,殷悦,骆云龙,林方珩,刘德斌.白消安抑制多发性骨髓瘤细胞恶性生物学特性的分子机制[J].中国实验血液学杂志,2023,31(05):1426-1431.