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骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13的表达及其临床研究

2023-11-15 92 上传者：管理员

摘要：目的探讨上皮型E-钙粘蛋白(E-cad)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在骨肉瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法选取经外科手术治疗的骨肉瘤患者58例作为研究对象，采集患者术后病理组织，并采用免疫组化法检测骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13的表达，分析其与患者临床病理特征的关系。结果骨肉瘤组织中的E-cad高表达低于癌旁组织、MMP-13高表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤患者组织中E-cad、MMP-13高表达与不同TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与不同性别、年龄、组织学分级无关(P>0.05);Spearman相关分析结果显示，骨肉瘤组织中E-cad表达与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(γ<0,P<0.05);MMP-13表达与TNM分期、淋巴结转移呈正相关(γ>0,P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示，E-cad高表达的总生存率高于无或低表达，差异有统计学意义(Log Rankχ2=4.753,P=0.029);MMP-13高表达的总生存率低于无或低表达，差异有统计学意义(Log Rankχ2=8.135,P=0.004)。结论骨肉瘤组织中E-cad呈无或低表达，MMP-13呈高表达，E-cad、MMP-13表达与临床病理特征密切相关，可作为临床评估骨肉瘤患者预后的生物标志物。

关键词：
上皮型E-钙粘蛋白
临床病理特征
基质金属蛋白酶-13
骨肉瘤
骨肿瘤
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骨肉瘤是原发恶性骨肿瘤中较为常见的一种，其特点是肿瘤细胞可直接产生骨样组织。骨肉瘤初期常见症状为疼痛及肿胀，因其多发于青少年群体，临床上易与生长痛混淆，因而大部分患者就诊时已处于中晚期[1]。有数据显示，骨肉瘤患者经临床治疗后5年生存率为65%,但发生转移的患者生存率仅在20%～30%[2]。因此，早期明确骨肉瘤患者病理特征，及时采取有效干预措施，对延长患者生存期尤为重要。上皮型E-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)可介导细胞间黏附，E-cad下调可降低组织内细胞黏附的强度，增加细胞活动性，在多种恶性肿瘤中呈低表达情况[3]。基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase13,MMP-13)可分解细胞外基质，参与机体多种生理与病理过程，在多种恶性肿瘤的侵袭与转移中发挥着重要作用[4]。目前，临床上关于E-cad、MMP-13与骨肉瘤患者病情变化的关系尚未明确。基于此，本研究旨在分析骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13的表达及其与临床病理特征的关系。现报告如下。

1、材料与方法

1.1 一般资料

本研究经我院医学伦理委员会批准。选取2019年1月至2020年12月期间本院收治的骨肉瘤患者58例为研究对象。性别：男性40例，女性18例；年龄14～30岁，平均(22.39±4.52)岁。纳入标准：①符合《外科学·第9版》[5]中关于骨肉瘤的诊断标准，经病理检查确诊为骨肉瘤；②行外科手术治疗，且术前均未接受过放化疗、免疫治疗等；③知情同意书中相关条目均被患者及其家属知悉、签订。排除标准：①存在慢性骨髓炎、骨巨细胞瘤、尤文肉瘤等疾病；②合并其他类型的恶性肿瘤；③合并传染性疾病；④精神异常；⑤妊娠期或哺乳期女性。

1.2 组织中E-cad、MMP-13检测

经包埋制作的组织标本按照4 μm规格进行连续切片，60 ℃烤片3 h后置于二甲苯中浸泡脱蜡20 min, 并经无水乙醇、95%、90%、80%、70%梯度乙醇清洗5 min, 蒸馏水洗5 min。采用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline, PBS)冲洗3次，5 min/次，放置于PH 6.0柠檬酸盐缓冲液微波盒煮沸，放入切片后，中高档微波修复15 min, 之后放凉至室温，PBS冲洗3次，5 min/次；采用3% H2O2溶液中孵育10 min, 以灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min, 反复冲洗3次，5 min/次，分别加入E-cad、MMP-13一抗，置于4 ℃冰箱过夜，37 ℃恒温箱孵育45 min, PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗，PBS冲洗3次，5 min/次，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)染色10～15 min, 蒸馏水洗涤，树胶封片，置于显微镜下观察。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 阳性判读

采用双盲法阅片，细胞质或(和)胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机选取10个高倍镜(×400)视野，每个视野内最少有100个细胞。阳性细胞染色强度分值：无着色：0分，浅黄色：1分，黄色：2分，棕黄色：3分。阳性细胞所占百分比(阳性细胞数/总细胞数×100%):阴性：0%～1%为0分；1%<阳性率≤25%为1分；25%<阳性率≤50%为2分；50%<阳性率≤75%为3分；阳性率>75%为4分，染色强度×阳性细胞所占百分比=总评分。总评分0～4分为无表达或低表达；总评分5～12分为高表达。

1.4 临床资料收集及随访

通过本院电子病历系统收集患者临床资料，包括性别(男、女)、年龄、肿瘤组织学分级(高分化、中分化、低分化)、TNM分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期)、淋巴结转移等。以门诊复诊或电话方式进行随访，随访截止日期为2022年4月。记录患者总生存期(overall survival, OS),OS定义为从确诊日至随访截止日期或死亡时间。

1.5 统计学方法

收集的研究数据采用SPSS 25.0软件进行数据处理，经Shapiro-Wilk正态性检验并符合正态分布的研究数据采用(x¯±s)

表示，计数资料用例数或率表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，采用Spearman相关分析检验骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13表达与临床病理特征的相关性，采用Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存情况，采用Log Rank检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 骨肉瘤组织与癌旁组织中E-cad、MMP-13阳性表达比较

骨肉瘤组织中的E-cad无或低表达、MMP-13高表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 骨肉瘤组织与癌旁组织中E-cad、MMP-13阳性表达比较/例

2.2 骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13的表达及其与临床病理特征的关系

不同TNM分期、淋巴结转移的骨肉瘤患者的E-cad、MMP-13表达比较，差异有统计学意义(P<0.05),不同性别、年龄、组织学分级的骨肉瘤患者的E-cad、MMP-13表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13的表达及其与临床病理特征的关系/例

2.3 骨肉瘤组织中E-cad、MMP-13表达

Spearman相关分析结果显示，骨肉瘤组织中E-cad表达与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(γ=-0.522、-0.306,P<0.001、0.019);MMP-13表达与TNM分期、淋巴结转移呈正相关(γ=0.399、0.371,P=0.002、0.004)。

2.4 E-cad、MMP-13表达与患者生存预后的相关性

截止到2022年4月，58例患者中生存共51例，其中E-cad高表达共26例(96.3%)存活，E-cad无或低表达共25例(80.6%)存活；MMP-13高表达共32例存活，MMP-13无或低表达共19例存活。Kaplan-Meier生存分析显示，E-cad高表达的总生存率高于无或低表达，差异有统计学意义(Log Rank χ2=4.753,P=0.029);MMP-13高表达的总生存率低于无或低表达，差异有统计学意义(Log Rank χ2=4.082,P=0.043)。见图1-2。

3、讨论

骨肉瘤是骨恶性肿瘤中较为常见的一种类型，其肿瘤细胞可直接产生骨样组织，可累及骨膜、骨皮质及髓腔，患者可表现为骨骼、关节疼痛、局部肿块等症状，具有进展迅速、恶性程度高、早期转移、病死率高等特点。近年来，因骨肉瘤手术及放化疗方案不断发展，约有60%的患者可获得长期生存[6]。但余军林等[7]研究表明，转移性骨肉瘤患者的病死率仍处于较高水平。因此，对骨肉瘤发生发展及转移的分子机制进行深入性的系统研究具有重要的临床意义。

图1 骨肉瘤组织中E-cad表达对患者的Kaplan-Meier生存曲线图

图2 骨肉瘤组织中MMP-13表达对患者的Kaplan-Meier生存曲线图

E-cad是钙粘蛋白家族成员之一，主要存在于上皮细胞、部分间质细胞中，可介导细胞间黏附，维持细胞极性及上皮细胞形态完整等。在组织结构的构建、重塑、维护及生物发育过程中，细胞外信号、细胞膜受体与细胞内信号信使间的相互作用具有重大意义。国内外研究表明，E-cad无或低表达与鼻咽癌、甲状腺癌、结直肠癌等实体肿瘤发生发展具有密切相关性[8,9]。且毕虎等[10]的研究表明，E-cad在骨肉瘤组织中的表达低于骨软骨瘤组织。本研究结果显示，骨肉瘤组织中的E-cad无或低表达高于癌旁组织，与上述研究结果较为一致。E-cad可介导细胞间黏附，其表达下调或缺失，可导致细胞间黏附力下降，细胞间连接松散，增加细胞活动性，导致原位细胞更易发生侵袭及转移[11]。本研究中E-cad表达与TNM分期、淋巴结转移有关，且E-cad无或低表达患者的总生存率低于高表达患者，说明E-cad表达与骨肉瘤患者病情有关，且其表达越低，患者预后越差。研究表明，肿瘤细胞可脱离原发灶，黏附在细胞外基质通过降解基质来实现向其他部位侵袭、转移目的[12]。而E-cad可维持机体组织结构，可通过改变细胞微环境影响细胞分化过程；且E-cad可抑制细胞迁移，维持原位功能，当其表达降低或缺失时，会降低或破坏细胞间黏附作用，致使上皮细胞-间充质转化，细胞极性丢失，肿瘤细胞获得了较强的抗凋亡、迁移、侵袭及降解细胞外基质的能力，肿瘤浸润深度增加，易向远处转移，因而促进骨肉瘤发生、发展；此外，E-cad可启动抑癌基因超甲基化，其表达下调或缺失，会降低抑癌基因超甲基化表达，增强肿瘤细胞的侵袭、浸润能力，进而促进骨肉瘤发生、发展[13,14]。

基质金属蛋白酶具有降解细胞外基质、破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障的作用，与肿瘤血管生成、转移、侵袭浸润等过程具有密切关系[15]。目前，临床上认为恶性肿瘤转移的首发条件为细胞外基质间的黏附及降解。MMP-13是基质蛋白酶金属家族中主要降解Ⅰ-Ⅳ型、X型胶原纤维、粘蛋白、纤维连接蛋白等类型，其在结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中均有表达[16]。本研究中，骨肉瘤组织中MMP-13高表达情况大于癌旁组织，这与崔涛等[17]的研究结果一致。MMP-13表达上调，会增强其降解细胞外基质能力，致使肿瘤细胞屏障及极性被破坏，调控细胞与基质间的黏附作用，致使上皮细胞-间充质转化，致使肿瘤细胞脱离原发灶，向其他部位侵袭、转移。本研究中MMP-13高表达与TNM分期、淋巴结转移有关，且MMP-13高表达患者的总生存率低于无或低表达患者，说明MMP-13与骨肉瘤患者疾病分期、淋巴结转移有关，且其表达越高，患者预后越差。MMP-13可破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，促进肿瘤侵袭、转移。且MMP-13高表达可促进破骨细胞进行骨吸收，其可降低抑癌蛋白M及载脂蛋白SAA3活性，促进肿瘤细胞生长、分化、增殖。此外，MMP-13可调控ERK1/2信号通路，来上调活化T细胞核因子1蛋白等蛋白表达，增强破骨细胞活性，促进胶原降解，增加骨重吸收，进而促进骨肉瘤发生发展，缩短患者的生存期[18]。此外，MMP-13高表达可协同纤维蛋白溶解酶、组织蛋白酶等，降解血管周围基质及基底膜，增强肿瘤血管生成能力，促进骨肉瘤发生发展，导致患者生存期较短。

综上所述，骨肉瘤组织中E-cad呈无或低表达，MMP-13呈高表达，且二者表达异常与骨肉瘤患者的临床病理特征有关，可作为骨肉瘤患者预后评估的生物标志物。但本研究也存在一定局限性，本研究为单中心研究，样本量较少，可能会导致结果偏倚，未来可进行大样本的系统研究，以进一步证实本研究结论。

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