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HPV-16整合人宿主基因组的情况及在宫颈癌筛查中的应用

2023-11-15 96 上传者：管理员

摘要：目的探讨宫颈癌及癌前病变中的HPV-16整合人宿主基因组的发生情况及其在宫颈癌筛查中的应用。方法收集宫颈癌患者50例、 LSIL 127例、HSIL 83例，另外收集同时期行子宫全切术提取的正常宫颈上皮组织22例。采用重叠PCR检测HPV-16感染病毒整合状态。结果正常宫颈上皮组织、 LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HR-HPV阳性检出率分别为13.64%、33.07%、61.45%以及94.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05。正常宫颈上皮组织、 LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HPV-16感染率分别为4.55%、18.90%、36.14%以及66.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05。正常宫颈上皮组织、 LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HPV-16整合率分别为0、17.32%、9.64%以及58.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05。结论 HPV16整合感染与宫颈病变疾病进展有关，在HPVDNA检测的基础上联合对高危HPV整合感染状态进行检测，有利于提高宫颈癌筛查准确率并在早期预测宫颈病变的转归。

关键词：
临床价值
人乳头瘤病毒
女性
宫颈癌
整合状态
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据报道[1],全球范围内约19万/年病例死于宫颈癌，且大多数死亡病例主要来源于发展中国家。目前在我国宫颈癌疾病的新发病例约为10万/年，在全球范围内占据33%左右，严重威胁女性身体健康[2]。由此，积极防治宫颈癌疾病尤为重要。宫颈癌的关键感染因素为生殖道人类乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。研究称[3],仅仅存在HPV感染者发生宫颈癌几率较低，但存在高危型HPV感染，且HPV病毒与宿主基因间存在整合状态，宫颈癌变几率则显著增加。多项研究均表明[4,5],宿主基因不同DNA开放读码框架位置，HPV病毒均能够与宿主基因发生整合。研究证实[6],高危HPV整合宿主基因比较常见的缺失部位在E2基因铰链区域。高危型HPV病毒存在多种类型，如HPV-16、HPV-18、HPV-30等，其中常见的为HPV-16型病毒。本次研究主要采用重叠PCR技术检测宫颈不同程度病变组织中HPV-16 E2基因的缺失情况，进而预测HPV-16与宿主基因之间的整合状态，判断其整合状态与宫颈癌病变关系，研究内容如下。

1、材料与方法

1.1 标本的收集

收集2019年1月至2021年6月在我院就诊的宫颈癌患者50例、 LSIL 127例、HSIL 83例，另外收集同时期在我院进行子宫全切术提取的正常宫颈上皮组织22例。纳入标准：①均符合《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南》中关于宫颈癌及宫颈癌癌前病变的诊断标准[7],且均经过病理组织检查；②年龄27～68岁；③既往均未接受放化疗治疗；④近3个月内均无性激素服用史；⑤均无免疫系统疾病史。排除标准：①合并其他外科或者内科疾病者；②近3天内存在性生活史及阴道冲洗史等；③合并阴道炎症疾病史者；④无法随访者。本次研究纳入的所有患者均已签署知情同意书，且已获取我院伦理委员会批准。

宫颈癌(n=50):Ⅰb期22例，Ⅱa期28例；组织分化程度：低分化15例，中分化13例，高分化22例；淋巴结转移：阴性者33例，阳性者17例。

1.2 细胞系

购买宫颈癌细胞株SiHa、CasKi, 将其置于含有10%胎牛血清溶液的DMEM培养基内进行培养。

1.3 DNA的提取

获取上述组织，切片，厚度为1 μm即可，予以30 μL蛋白酶K溶液、30 μLSDS溶液、500 μLTES溶液，置于56 ℃水浴，72 h后，按照25∶24∶1比例加入酚：氯仿：异戊醇，离心，获取下层沉淀，加无水乙醇溶液，再加3 mol/L乙酸钠溶液，离心，去除上层溶液，沉淀干燥处理，再予以适量的TE溶液，提取DNA。

1.4 HPV-16感染的确定

(1)DNA水平：

设计HPV-16 E7上游引物序列(5'-AGCCAGTGATCGTC-3')、下游引物序列(5'-AGACGTGCCTGATC-3')。采用PCR技术检测确定是否存在HPV-16感染；

(2)蛋白水平：

采用免疫组化SP法检测组织内HPV-16 E7表达水平。10%多聚甲醛溶液固定，不同梯度酒精溶液脱水，常规石蜡包埋，制作切片，抗原修复处理，SP法染色，具体操作步骤均按照试剂盒说明书。将该蛋白表达切片作为阳性对照组，将PBS溶液的切片作为阴性对照组。结果判定：随机选取10个视野，阳性细胞数在26%～50%为+,阳性细胞数在51%～75%为++,阳性细胞数≥76%为+++。细胞核呈现棕黄色表示HPV-16 E7为阳性表达(HPV-16 E7单克隆抗体：美国 Santa cruz公司；SP试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司)。

待DNA及蛋白水平表达均呈现阳性时，即可确定HPV-16感染。

1.5 HPV-16整合的确定

HPV-16感染的患者，应用重叠PCR技术扩增HPV-16 E2,确定此基因交叉序列的片段是否出现病毒整合。设置引物序列，片段A:上游序列：5'-AGCCGTGTCATGAC-3',下游序列：5'-AGCATTGGATGCCC-3',引物长度为476bp; 片段B:上游序列：5'-AGGGACCTCATGTC-3',下游序列：5'-ATTGGCAGCGATCC-3',引物长度为477bp; 片段C:上游序列：5'-AGGCTGACTTGACC-3',下游序列：5'-ACTCGCTTAGAGGC-3',引物长度为277bp。若上述片段A、B及C无法同时阳性扩增，表明HPV-16 E2基因存在缺失，说明HPV-16整合状态。

1.6 统计学方法

应用SPSS 25.0软件分析，Excel表格计算，定量资料以(x¯±s)

表示，采用t检验。定性资料以%表示，采用χ2检验。P<0.05存在统计学差异。

2、结果

2.1 各组HR-HPV的检测

在正常宫颈上皮组织、LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HR-HPV阳性检出率分别为13.64%、33.07%、61.45%以及94.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05,见表1。

表1 各组HR-HPV的检测(例，%)

2.2 不同病变程度宫颈上皮组织中HPV-16感染率的比较

在正常宫颈上皮组织、LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HPV-16感染率分别为4.55%、18.90%、36.14%以及66.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05,见表2。

表2 不同病变程度宫颈上皮组织中HPV-16感染率的比较

2.3 不同病变程度宫颈上皮组织中HPV-16整合率的比较

在正常宫颈上皮组织、LSIL、HSIL及宫颈癌组织中，HPV-16整合率分别为0、17.32%、9.64%以及58.00%,上述任意两组进行统计分析，P<0.05,见表3。

表3 不同病变程度宫颈上皮组织中HPV-16整合率的比较

3、讨论

目前关于宫颈癌疾病的发病机制尚且未完全阐明，但是大部分研究学者均证实，宫颈癌疾病产生关键因素为HPV病毒感染，尤其高危型HPV病毒感染是导致宫颈癌疾病发生的关键原因[8]。HPV-16型病毒是引发宫颈癌发生的常见类型。而在本次研究结果发现，在不同宫颈病变程度的组织中，HPV-16感染率均存在统计学差异，且病变程度越高，HPV-16感染率越高。并且HPV-16与宿主基因之间整合率达到了58%,宫颈组织病变程度越高，HPV-16整合率也越高。上述研究均表示HPV-16感染与宫颈病变程度存在关系，进一步说明宫颈组织病变过程中，HPV-16整合状态可能是其主要危险因素之一。

相关研究表示[9],大多数机体HPV病毒感染属于一过性，感染机体半年后会出现自行消退的现象。但若机体宿主基因出现缺陷或者突变，HPV病毒基因部分片段与突变或缺陷的宿主基因整合，进而引起细胞基因调控紊乱[10]。如果HPV病毒在复制过程中出现异常停留在某一个时相，HPV病毒便出现持续性感染的现象，尤其高危型HPV病毒，宫颈细胞出现恶性转化几率大大增加。研究表明[11],宫颈组织发生病变的过程中，其早期阶段可能发生了HPV病毒与宿主基因之间的整合，但是关于整合具体时相发生机制还需要进一步研究。也有部分研究称[12],宿主宫颈病变组织，HPV病毒感染除了整合感染以外，可能存在其他状态感染，关于HPV-16型整合感染与宫颈组织的机制大量实验研究，但是HPV-16可以用于预测宫颈病变患者转归。

临床上常见的宫颈癌筛选方法主要为HPV DNA,且近几年随着高危型HPV与宫颈癌之间的关系逐渐被确定，HPV DNA联合细胞学检查方式逐渐吸引越来越多研究学者的关注，并且被大量用于临床检测，但是HPV DNA方法存在一些缺陷，即无法确定HPV病毒与宿主基因整合情况。且部分研究表示[13],在湿疣病变患者以及 LSIL患者中，HPV整合率较低，在癌变中才出现。本次研究结果发现，在 LSIL发生HPV-16感染病例中存在17.32%的整合率，在HSIL中整合率也有9.64%,且在宫颈癌组织中HPV-16整合率达到了58%,表明在宫颈组织病变整个过程中，高危型HPV整合贯穿整个病变进展。由此进一步表明，通过采用快速HPV DNA检测以及联合检测HPV整合状态，可以有效提高检测特异度。

综上所述，HPV-16感染可导致宫颈组织病变，HPV DNA检测方法联合检测HPV整合状态，可进一步提高筛查特异度，有利于预测宫颈病变程度。

参考文献:

[2]邵招凤,戚秀秀,杨玲飞,等.宫颈上皮内瘤变患者感染高危型人乳头瘤病毒载量水平及临床意义[J].中华医院感染学杂志,2021,31(22):3453-3457.

[3]梁婷婷,杨勇霞,侯丛哲,等.PAX1基因甲基化与宫颈高级别上皮内病变及高危型HPV分型的关联性[J].山东大学学报(医学版),2021,59(11):48-52.

[6]韩会娟.HPV16/18在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J].江苏医药,2014,40(9):1052-1054.

[7]宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)[J].中国医学前沿杂志(电子版),2013,5(08):37-46.

[8]余娟娟,王爱红,王瑞芳,等.宫颈上皮内瘤变患者宫颈锥切术后发生高危型HPV持续感染的影响因素分析[J].内科,2021,16(5):569-572.

[10]戴荣华.宫颈癌组织基因组中HPV病毒整合热点检测及相关基因功能分析[D].上海交通大学,2017.

[12]卢仲明,李奕萱,许咪咪,等.高危型人乳头状瘤病毒16/18在喉癌中的感染及整合状态[J].实用医学杂志,2016,32(9):1422-1424.

文章来源:郭瑞丽,朱科科,赵静.宫颈癌及癌前病变中的HPV-16整合人宿主基因组的发生情况及其在宫颈癌筛查中的应用[J].实用癌症杂志,2023,38(11):1810-1812+1816.