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PLK2协同p21影响骨肉瘤细胞增殖的作用机制

2024-04-15 98 上传者：管理员

摘要：目的通过实验研究PLK2协同p21影响骨肉瘤疾病发生发展的潜在作用机制。方法从GEO数据库获取骨肉瘤组织与正常组织的lncRNA差异化表达；准备HEK293T细胞和U2OS、Sao-2人骨肉瘤细胞系进行培养，利用siRNA技术在U2OS细胞系中抑制PLK2的表达并实施敲低试验，从U2OS细胞中分离细胞总RNA进行实时定量聚合酶链反应，对U2OS细胞系实施免疫印迹（IB）和免疫沉淀（IP）分析，再对其进行EdU实验和细胞活力测定，最后使用SPSS 17.0版本进行统计学分析，将癌组织与癌旁正常组织进行比较。结果与正常组织相比，PLK2在骨肉瘤组织中表达更低；在构建的两种敲低PLK2的小干扰RNA和携带PLK2的重组质粒转染到U2OS细胞实验中，PLK2敲除后发现U2OS细胞的增殖能力增强，而PLK2过表达则相反。在U2OS细胞中检测PLK2和p21的体内相互作用，发现p21的蛋白水平与PLK2的蛋白水平变化一致且差异具有统计学意义。结论 PLK2参与了抑制骨肉瘤细胞增殖的过程，可能是通过与p21相互作用而发生的。

关键词：
P21
PLK2
细胞增殖
蛋白互作
骨肉瘤
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骨肉瘤（osteosarcoma,OS）被认为是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤类型之一[1]。骨肉瘤通常起源于长骨干骺端，有很高的远处转移倾向。转移性骨肉瘤患者通常伴有预后不良的特征[2]，平均5年生存率<20%。因此，了解骨肉瘤早期的关键机制以及更可靠的分子标志物有利于早期诊断。目前，骨肉瘤的治疗多采用大剂量的化疗和手术，但这往往会导致化疗副作用和耐药性，影响疗效[3]。临床研究表明，在不同类型的癌症中，p21的下调与不良预后相关，影响癌症进展[4]，这表明p21可能作为一个基因靶点，调节肿瘤细胞对化疗和放疗的反应。

Polo样激酶2 (Polo-like kinase 2,PLK2）是一种多功能蛋白，与多种癌症疾病细胞增殖、凋亡相关，在细胞周期进程中，PLK2的丰度、激酶活性和亚细胞分布可发生显著变化；在结直肠癌、胰腺癌等多种癌症疾病中处于失调状态[5]，然而PLK2在骨肉瘤中的表达状态和生物学功能尚不清楚。本研究通过实验探讨PLK2和p21对骨肉瘤的潜在作用机制，旨在寻找骨肉瘤新的生物标志物和治疗靶点，为骨肉瘤的临床和基础研究提供参考。

1、材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

实验细胞：U2OS、Saos-2人OS细胞系和HEK293T细胞系，均购自广州赛库生物技术有限公司。

主要试剂：MEM培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）、Lipofectamine RNAiMAX试剂、TRIzol试剂、Lipofectamine 3000试剂（美国Thermo Fisher公司）、PLK2质粒（上海GeneChem公司）、PLK2过表达质粒（上海Addgene公司）、si-PLK2敲低质粒（上海GenePharma公司）、RT-qPCR试剂盒（美国Invitrogen Life Technologies公司）、RIPA缓冲液（法国Pierce公司）、BCA检测试剂盒（中国Solarbio公司）、聚偏氟乙烯膜（美国Millipore公司）。

主要仪器：Cell Counting Kit-8系统（CCK-8，中国Engreen公司）、PCR仪（美国Thermo Fisher公司）、全自动CO2培养箱（日本三洋电机有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih）下载GSE16088归一化基因水平RNAseq数据。使用GSE16088数据集检测骨肉瘤组织与正常组织之间PLK2的基因表达。

1.2.2 细胞培养

将U2OS、Saos-2人OS细胞系和HEK293T细胞系置于37℃、90%湿度、5%二氧化碳（CO2）的MEM培养基中，加入10%胎牛血清（FBS）和青霉素（100 UI/mL）/strep‐tomcin(100 mg/mL），在CO2培养箱中培养。

1.2.3 转染敲低PLK2的小干扰RNA和过表达PLK2的质粒

利用siRNA技术在U2OS细胞系中抑制PLK2的表达，在敲低实验中，根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂处理U2OS细胞，用si-PLK2处理。转染后24 h更换培养基为全培养基，48 h收集细胞进行RNA表达检测。设计了两个HOXA1-AS siRNA来避免脱靶效应。再将723 ng/μL质粒用Lipofectamine 3000试剂在室温下转染72 h，然后进行后续实验。

1.2.4 逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR)

使用TRIzol试剂从U2OS细胞中分离细胞总RNA，并使用RT-qPCR试剂盒进行扩增。1μg总RNA经逆转录酶合成cDNA第一链，分别用正向引物5-TCTGTTTGCCAAA-GTTACCA-3和反向引物5-TTCTTCAAATCCATCTCCA-CTG-3检测PLK2。β-actin作为内参，用以下引物扩增：正向引物5-GTGGACATCCGCAAAGAC-3和反向引物5-A-AAGGGTGTAACGCAACTA-3。然后进行实时荧光定量PCR反应，检测PLK2在U2OS非转导细胞和转导细胞中的相对表达量。反应条件为：93℃、2 min,(93℃、1 min,55℃、1 min,72℃、1 min,40个循环），93℃、10 min，然后保持4 min。将完整长度的PLK2插入pCMV-Tag2B载体生成PLK2质粒。

1.2.5 免疫印迹（IB）和免疫沉淀（IP）实验

将细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解。根据制造商的说明，用BCA检测试剂盒测定全细胞裂解液的蛋白浓度。通过SDS-PAGE电泳分离并转移蛋白质裂解物（20μg）到PVDF膜上，再与一抗PLK2和GAPDH在4℃条件下孵育过夜，然后与相应的酶标二抗孵育。使用GAPDH作为对照。从U2OS细胞中提取总蛋白，然后进行免疫共沉淀实验：用400μL IP裂解缓冲液。将裂解液与40μL Protein A琼脂糖孵育；将相应的抗体置于旋转培养箱中过夜，温度为4℃。第二天将混合物置于4℃，5 939 g离心5 min，取上清液，PBS洗涤3次。用5X SDS‐PAGE上样缓冲液混合琼脂糖珠，在100℃下沸煮10 min，收集后进行Western blotting方法检测。使用IgG为阴性对照，全裂解液为阳性对照。

1.2.6 EdU实验

为进一步证实PLK2在体外增殖中的作用，对U2OS细胞系进行细胞增殖检测。将U2OS细胞接种于96孔板24 h后，使用Lipofectamine 3000转染相应的siRNA。转染48 h后，细胞与EdU中孵育4 h,4%甲醛固定30 min,2 mg/mL甘氨酸孵育5 min。根据制造商说明进行EdU分析的阴性阳性对照，再按照生产说明书使用荧光法进行检测。最后，用6-二氨基-2-苯基吲哚（Sigma-Aldrich）染色细胞核，用Olympus BX53进行荧光观察。

1.2.7 细胞活力试验

细胞活力测定采用CCK-8系统，按照生产厂家的说明进行。分别于0、1、2、3、4、5 d测定细胞增殖率。将细胞置于稀释于正常培养基中的10%CCK-8中，37℃孵育1 h。用450 nm的酶标仪测量每孔的吸光度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PLK2在OS细胞系和组织中的表达水平

提取GSE16088数据集，对PLK2在不同OS细胞系中的表达水平进行统计分析。结果发现：与正常组织相比，PLK2在骨肉瘤组织中表达更低（见图1A）。细胞培养后可见：与HEK293细胞相比，PLK2蛋白表达量（见图1B）和mRNA表达水平（见图1C）在OS细胞株Saos-2和U2OS中均下降。

图1 A.PLK2在GSE16088中的相对mRNA表达水平；B.PLK2在HEK293T、Saos-2和U2OS细胞中蛋白表达量；C.PLK2在HEK293T、Saos-2和U2OS细胞中相对mRNA表达水平

2.2 PLK2调节人OS细胞的增殖过程情况

通过Western blotting分析和RT-qPCR实验分别检测小干扰RNA敲低和质粒过表达的有效性，从而证实PLK2在细胞中的敲低和过表达效率。结果显示：在敲低组中siRNA-PLK2#1的蛋白表达量是对照组的20%左右（见图2A),mRNA表达量为对照组的20%左右（见图2C),siRNA-PLK2#2的蛋白表达量是对照组的15%左右（见图2A),mRNA表达量为对照组的25%左右（见图2C）；过表达组Plasmid-PLK2的蛋白表达量是对照组的3倍左右（见图2B),mRNA表达量是对照组的4.5倍左右（见图2D）。

其次分别使用敲低组（si-NC,si-PLK2#1,si-PLK2#2）和过表达组（vector,plasmid-PLK2）转染U2OS细胞，并进行CCK-8细胞增殖实验和EdU分析，结果发现与未处理组相比，PLK2敲低组（siPLK2#1和siPLK2#2）表现出明显的生长促进现象（见图2E），而PLK2质粒过表达组（pPLK2）的细胞表现出明显的生长抑制现象（见图2F）。EdU实验结果显示，当PLK2被转染的重组质粒过表达或被siRNA敲除时，也有类似的趋势（见图2G、H）。

图2 A.Western blotting检测下PLK2敲低组的蛋白水平；B.Western blotting检测下PLK2过表达组的蛋白水平；C.RT-qPCR检测下PLK2敲低组的m RNA表达水平；D.RT-qPCR检测下PLK2过表达组的m RNA表达水平；E.CCK-8分析下PLK2敲低组在U2OS细胞中的细胞增殖量（吸光度）；F.CCK-8分析下PLK2过表达组在U2OS细胞中的细胞增殖量（吸光度）；G.EdU分析下PLK2敲低组在U2OS细胞中质粒表达；H.EdU分析下PLK2过表达组在U2OS细胞中质粒表达

2.3 PLK2与p21蛋白水平相关性分析

通过免疫印迹（IB）和免疫共沉淀（Co-IP）实验，结果显示：P21在体内与PLK2形成了复合物（见图3A、B）。进一步探究p21在骨肉瘤中的作用，笔者检测了PLK2对p21表达水平的影响。结果显示：与对照细胞相比，当PLK2被敲低时p21蛋白水平下降（见图3C左）；转染PLK2过表达质粒的U2OS细胞中p21蛋白水平增加（见图3C右）。

图3 A、B.PLK2和p21相关性的免疫共沉淀分析图；C.Western blotting检测下PLK2敲低组和过表达组的p21蛋白水平

3、讨论

骨肉瘤已经被研究了很长一段时间，但其形成和发展的潜在机制目前还不明确，与其他类型的癌症一样，骨肉瘤通常被认为与肿瘤抑制基因和癌基因的失调有关。研究发现，p21信号被认为是调节骨肉瘤进展的一个途径[6,7]。此外，有证据表明，缺乏p21的小鼠易于发展出广泛的肿瘤类型，这意味着p21可能作为一种肿瘤抑制因子[8]。哺乳动物类PLK家族包括5个成员：PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5。PLK家族是一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族[9]，其羧基末端显示一个polo-box结构域（PBD）。PLK2作为PLK家族一员，能够参与许多不同的生物学功能，如DNA损伤反应、细胞周期控制和凋亡过程[10]，而在骨肉瘤中的功能仍然知之甚少。

PLK2与p21可相互作用，共同参与细胞生长过程，研究表明，上皮细胞转化序列2(Ect2）可通过调节细胞周期相关基因p21促进细胞增殖，而p21是Rb蛋白介导的G1期阻滞所必需的，所以p21表达有助于细胞周期阻滞[11]。相关实验发现PLK2过表达能将颗粒细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期，从而阻滞细胞周期[12]，所以二者在细胞周期阻滞方面可能具有协同作用。Nrf2-Lnc RNA是一个新发现的lncRNA，在激活Nrf2方面具有独特的作用，Nrf2对细胞生存的应激密切相关，且伴随着肿瘤抑制因子p53的激活，共同参与细胞凋亡进程。研究发现，PLK2和p21均具有激活Nrf2作为Nrf2-lncRNA下游靶点的能力，细胞可通过调节Nrf2-lncRNA的水平来激活Nrf2，使其通过协同系统调节PLK2和p21，进而影响细胞[13]。

在本次研究中，首先通过生物信息学观察到PLK2在骨肉瘤组织和细胞系中蛋白表达量和mRNA表达水平均下调。再利用siRNA技术或质粒转染在U2OS细胞系中抑制或者促进PLK2的表达，笔者发现当PLK2被敲低后，OS细胞增殖能力增强；相比之下，过表达PLK2则降低了OS细胞的增殖能力，并且通过EdU实验和细胞活力测定实验也发现了类似的现象。然后进一步利用免疫印迹和免疫沉淀实验探究PLK2与p21的相关性，结果发现二者可形成复合物，PLK2过表达时p21蛋白水平增加，敲低时减少，这说明PLK2与p21二者有协同作用，PLK2可能引起p21蛋白水平的翻译后修饰调控，同时影响p21活性，从而导致细胞周期阻滞。由此可以认为在骨肉瘤中PLK2的失调可影响体外细胞增殖能力，同时由于p21的蛋白水平随着PLK2的表达而变化，PLK2的功能可能依赖于与p21的蛋白互作，二者协同发挥作用影响细胞周期和肿瘤进展。

综上所述，本研究发现PLK2可能被认为是骨肉瘤靶向治疗的潜在候选药物，其可通过与p21的协同作用抑制骨肉瘤细胞增殖和肿瘤发生。

文章来源:陈子健,王嘉璐,李志钢.PLK2协同p21影响骨肉瘤细胞增殖的作用机制[J].生物骨科材料与临床研究,2024,21(02):6-9+15.