动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病[1],血管钙化在AS中普遍存在，Runt相关转录因子2(Runt transcription factor 2,RUNX-2)是经典钙化分子[2,3]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)在AS和钙化纤维帽中可见表达。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一种肠道细胞分泌的促胰岛素分泌激素，其受体激动剂可减轻体重、保护胰岛β细胞和保护心血管等[4,5,6]。有研究表明，GLP-1受体激动剂可以改变脂质合成和分泌以及改善内皮功能障碍而保护心脏[7]。但GLP-1对AS及血管钙化的作用及机制仍不明确。亲环蛋白A(cyclophilinA,CyPA)是免疫抑制剂环孢素A的胞内结合蛋白。当细胞受到炎性刺激或氧化应激时可将CyPA分泌到胞外，进而激活一系列通路而诱导损伤发生[8]。在AS中，内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板等能够在病理环境刺激下分泌CyPA,进而参与疾病进展[9]。减少CyPA分泌可能是抑制AS发生发展的途径之一。因此，本研究通过高脂喂养诱导ApoE-/-小鼠AS病变，观察GLP-1受体激动剂exendin-4[10]是否通过影响CyPA表达水平而改善疾病及抑制血管钙化，以期为AS的疾病治疗提供实验依据。

一、材料和方法

1. 实验动物

20只ApoE-/-小鼠和10只C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g, 购自海南药物研究所有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(琼)2020-0007。实验期间小鼠饲养环境温度20～24 ℃,湿度50%～70%,12 h 明暗交替，自由摄食、饮水，适应性饲养1周后开始实验。

2. 主要试剂

GLP-1R激动剂exendin-4(Prospec公司),甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)及CyPA检测试剂盒(上海酶研生物科技有限公司),血清钙检测试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司),油红O染液与HE染液(北京百奥博莱生物科技有限公司),Von Kossa染液(武汉赛维尔生物科技有限公司),DAB显色试剂盒(北京索莱宝生物科技公司),Trizol试剂盒(Invitrogen公司),反转录合成试剂盒与Real-time PCR检测试剂盒(Takara公司),RIPA裂解液、超敏ECL显色液及DAPI染料(上海碧云天生物研究所),Bradford蛋白定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司),兔抗Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2)多克隆抗体、兔抗BMP-2多克隆抗体、兔抗CyPA多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体及Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体(Abcam公司)。

3. 建立动物模型和给药

将20只 ApoE-/-小鼠随机分为模型组和exendin-4组，每组10只，高脂饲料喂养以建立动脉粥样硬化模型。以10只野生型C57BL/6J小鼠作为对照组，给予普通饲料喂养。3组小鼠喂养8周后，exendin-4组腹腔注射GLP-1R激动剂exendin-4(5 μg/kg),模型组和对照组小鼠注射等体积生理盐水，1次/d, 持续8周。

4. 油红O染色检测主动脉粥样硬化斑块发展

剥离小鼠主动脉，置于4%多聚甲醛溶液固定48 h后，PBS缓冲液冲洗，将其浸入油红O工作液，室温避光染色1 h后弃去染液，60%异丙醇冲洗，将主动脉固定于黑色蜡皿上，体式显微镜下观察染色情况并摄片，通过Image J v1.8.0.112 软件测量并计算斑块面积比例，斑块面积比例(%)=斑块面积/主动脉总面积×100%。

5. HE染色观察主动脉病理学变化

取小鼠主动脉根部，4%多聚甲醛溶液固定48 h后，石蜡包埋，制备组织切片后HE染色，在光学显微镜下观察主动脉病理形态学变化并摄片。

6. Von Kossa染色观察主动脉钙盐沉积情况

小鼠主动脉根部组织切片常规脱蜡后水化，蒸馏水洗涤后，将切片浸入5%硝酸银溶液中，置于紫外线下照射60 min。结束后，蒸馏水洗涤，利用5%硫代硫酸钠溶液定影处理5 min, 再次洗涤切片，碱性品红溶液复染2 min, 切片冲洗干净后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察主动脉钙盐沉积情况并摄片。

7. 血清制备及生化指标检测

给药结束后，禁食、禁水14 h, 心脏穿刺收集血液，室温静置，以4000 ×g离心10 min, 获得血清后，采用ELISA法测定TG、TC、HDL-C、LDL-C、CyPA水平，甲基麝香草酚蓝比色法检测血清钙水平，操作步骤严格按照各个试剂盒说明书进行。

8. 免疫组织化学检测主动脉RUNX2与BMP-2表达

小鼠主动脉根部组织切片常规脱蜡后水化，PBS缓冲液冲洗，置于1 mmol/L EDTA溶液高温煮沸修复抗原10 min, 滴加3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，10%山羊血清室温封闭30 min。弃封闭液，分别滴加兔抗RUNX2多克隆抗体(1∶200)、兔抗BMP-2多克隆抗体(1∶200),4 ℃孵育过夜。次日，弃一抗液，PBS缓冲液洗涤，滴加HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1000),37 ℃孵育30 min, 将切片充分冲洗，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察主动脉切片染色情况并摄片。染色结果呈黄棕色至棕色为阳性表达，随机选择6个视野摄片，通过Image J v1.8.0.112软件测量并计算RUNX2与BMP-2阳性染色面积比例。

9. Real-time PCR测定主动脉组织内RUNX2与BMP-2 mRNA表达

Trizol法提取主动脉组织总RNA,反转录后通过Real-time PCR扩增以检测RUNX2与BMP-2 mRNA表达水平，总反应体系为20 μl, 扩增条件为95 ℃ 10 min, 1个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min, 40个循环。扩增结束后，以GAPDH作为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因的转录水平，重复实验3次。 基因引物序列具体如下：RUNX2上游引物5’-G C C T T C A A G G T T G T A G C C C T-3’,下游引物5’-T GA A C C T G G C C A C T T G G T T T-3’ (产物长度133 bp); BMP-2上游引物5’-G GA C G T C C T C A G C G A G T T T-3’,下游引物5’-C AG G T C G A G C A T A T A G G G G G-3’ (产物长度106 bp);GAPDH上游引物5’-T GA C A A C T T T G G C A T C G T G G-3’,下游引物5’-G GG C C A T C C A C A G T C T T C T G-3’ (产物长度78 bp)。

10. Western blotting测定主动脉组织内RUNX2与BMP-2蛋白表达

RIPA裂解液提取主动脉组织总蛋白，Bradford法进行蛋白定量。上样量为40 μg, 10% SDS-PAGE电泳，蛋白分离后转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 弃去封闭液，加入兔抗RUNX2多克隆抗体(1∶1000)、兔抗BMP-2多克隆抗体(1∶1000),4 ℃ 孵育过夜。TBST洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5000),室温孵育1 h, TBST洗膜 3次， ECL显色液显影，Image J v1.8.0.112软件计算各蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH蛋白灰度值之比作为目的蛋白相对表达量。

11. 免疫荧光染色检测主动脉组织CyPA阳性表达

取制备的主动脉根部组织切片，PBS洗涤，在切片上滴加10%山羊血清封闭液，置于室温下封闭后，滴加兔抗CyPA多克隆抗体(1∶200),4 ℃孵育过夜。次日，PBS洗涤干净后，滴加Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶500),室温下避光孵育1 h, PBS再次洗涤后，滴加DAPI工作液避光孵育15 min, 再将切片洗净，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察主动脉组织染色情况并摄片。

12. 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行实验数据分析，通过GraphPad Prism 8.30软件绘制统计图。计量资料用均值±标准差

表示，多组间比较采用One-Way ANOVA,组间两两比较采用LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 各组小鼠主动脉粥样硬化斑块形成情况

结果显示，模型组小鼠主动脉粥样硬化斑块面积较对照组显著增加(P<0.05);exendin-4组较模型组小鼠主动脉粥样硬化斑块面积显著减少(P<0.05),见图1。

2. 各组小鼠主动脉形态变化观察

HE染色显示，对照组小鼠主动脉血管内皮结构完整、光滑，膜内细胞均匀分布，未见炎性细胞浸润；相较于对照组，模型组小鼠主动脉壁明显增厚，结构紊乱，膜内细胞排列不整齐，可见大量炎性细胞浸润；而与模型组比较，exendin-4组小鼠主动脉壁未见明显增厚，炎性细胞浸润也明显减轻，见图2。

3. 各组小鼠主动脉组织中钙盐沉积比较

染色结果显示，对照组小鼠主动脉壁上有少量暗色颗粒，说明钙盐沉积较少；与对照组比较，模型组小鼠主动脉壁上可见大量暗色物，说明钙盐沉积较多；与模型组比较，exendin-4组小鼠主动脉壁上暗色物较少，说明钙盐沉积减少，见图3。

图1 各组小鼠主动脉斑块面积比较  

图2 各组小鼠主动脉形态学观察HE染色   

图3 各组小鼠主动脉钙盐沉积情况Von Kossa染色  

表1 各组小鼠血脂、血钙及CyPA水平

4. 各组小鼠血脂、血钙及CyPA水平比较

与对照组比较，模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05),Ca和CyPA水平也显著升高(P<0.05); 与模型组比较，exendin-4组小鼠血清中TG、TC、LDL-C、Ca及CyPA水平均显著降低(P<0.05),见表1。

5. 各组小鼠主动脉组织RUNX2与BMP-2阳性表达比较

结果显示，与对照组比较，模型组小鼠主动脉组织内膜RUNX2与BMP-2棕色染色阳性表达面积比例显著增加(P<0.05);与模型组比较，exendin-4组小鼠主动脉组织内膜RUNX2与BMP-2棕色染色阳性表达面积比例显著减少(P<0.05),见图4。

6. 各组小鼠主动脉组织RUNX2、BMP-2在mRNA与蛋白水平上的表达比较

检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠主动脉组织RUNX2、BMP-2的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05);与模型组比较，exendin-4组小鼠主动脉组织RUNX2、BMP-2的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),见图5。

图4 各组小鼠主动脉组织RUNX2与BMP-2阳性表达免疫组织化学标尺示200μm  

图6 各组小鼠主动脉组织CyPA荧光表达免疫荧光染色标尺示200μm   

图5 Real-time PCR和Western blotting测定各组小鼠主动脉组织RUNX2与BMP-2表达水平

7. 各组小鼠主动脉组织CyPA阳性表达比较

结果中红色荧光代表CyPA表达，可见模型组小鼠主动脉组织内红色荧光较对照组明显增强，表明CyPA表达升高；而exendin-4组小鼠主动脉组织组织内红色荧光较模型组明显减弱，表明CyPA表达降低，见图6。

三、讨论

动脉粥样硬化(AS)是一个复杂的病理生理过程，其主要特征是胆固醇/脂质代谢紊乱与慢性炎症，从而破坏动脉壁微环境并导致主动脉中斑块形成。GLP-1受体激动剂具有广泛的药理作用[11]。已有研究表明，GLP-1受体激动剂通过调控AS小鼠模型中的炎症通路而减轻斑块病变的发展[12]。此外，GLP-1受体激动剂可能受抗炎机制驱动，抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，从而减缓AS的病理进程[13]。大量研究显示，脂质代谢紊乱是AS发病和发展的关键步骤，AS的发生伴随着TG、TC和LDL-C的增加[14,15]。本研究通过给予AS小鼠GLP-1受体激动剂exendin-4,并进行主动脉粥样硬化斑块及TG、TC和LDL-C水平的比较，发现其能够改善AS的疾病进展。

作为AS中常见的特征，血管钙化是羟基磷灰石在动脉中的异常沉积导致动脉壁增厚和硬化，降低了血管壁弹性，致使血管腔变窄，进而导致组织或器官缺血、坏死，是后续心血管疾病发生的一个独立危险因素[16]。RUNX2是一种重要的成骨转录因子，在血管钙化过程中起主导作用。RUNX2的激活会加速脉管系统中平滑肌细胞钙化，而RUNX2的表达缺失则会阻止这一过程[17]。BMP-2是调节骨形成和血管钙化的关键分子，在与其受体结合后，BMP-2通过促使Smad 1、Smad 5和Smad 8的磷酸化增加RUNX2的表达，进而加快AS中血管钙化的发生发展[18]。本研究结果显示，AS小鼠会发生血管钙化，在经过exendin-4治疗后，AS小鼠血管钙化有所改善，说明exendin-4有助于抵抗AS小鼠病情的进一步恶化。

AS发生发展及其血管钙化的机制复杂，目前尚不完全清楚。CyPA属于亲免素超家族，作为一种普遍分布在细胞内和细胞外空间中的蛋白质。以往研究表明，细胞外分泌的CyPA通过许多重要的细胞内机制参与AS的发展过程，并与AS的各种危险因素密切相关，包括高脂血症、高血压和糖尿病[19,20,21]。此外，CyPA能够触发内皮细胞的损伤和凋亡，导致内皮功能障碍[22],CyPA还对炎症细胞如单核细胞和T淋巴细胞表现出强大的趋化作用，促进促炎细胞因子产生，加快AS斑块形成和斑块的不稳定性[23]。由此可见，探讨可以靶向抑制CyPA分泌的分子或药物，可能为AS的预防和介入治疗策略提供新的方向。本研究结果显示，exendin-4治疗能够抑制AS小鼠血清中及主动脉组织内CyPA的水平。

本研究证明了exendin-4治疗能够改善AS小鼠的血管钙化，并且exendin-4发挥作用是通过影响CyPA的表达水平，为AS及血管钙化的临床治疗提供了理论依据，对exendin-4改善AS中脂质代谢、斑块形成以及主动脉壁增厚与炎性细胞浸润的作用机制有更深入的了解，也为抑制AS中CyPA的分泌提供了新途径。

综上所述，本研究结果表明，exendin-4能够抑制小鼠AS进展及血管钙化，并且这种作用可能依赖对CyPA分泌的调控。

参考文献:

[11]张贵龙.GLP-1受体激动剂临床应用研究进展[J].中国城乡企业卫生,2021,36(4):31-34.

基金资助:海南省卫生健康行业科研项目(20A200179);

文章来源:杨珊珊,潘宇翔,郑婉,等.Exendin-4抑制亲环蛋白A减轻动脉粥样硬化模型小鼠病理表型[J].解剖学报,2024,55(02):229-236.