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IDH1突变通过影响软骨分化促进软骨肿瘤的发生

2024-06-12 344 上传者：管理员

摘要：目的:研究IDH1突变在软骨肿瘤发生过程中对软骨分化能力的影响。方法:利用Sanger测序法，检测收集的人软骨肿瘤石蜡标本中IDH1的突变情况；诱导小鼠胚胎间充质干细胞向成骨细胞分化，转染IDH1 R132H位点突变的质粒，观察细胞分化情况；分离培养IDH1突变小鼠的原代软骨细胞，Real-time PCR方法检测软骨分化标志分子Sox9和Col-II以及软骨细胞肥大标志分子Runx2和Col-X基因的表达水平；构建软骨组织特异性突变的IDH1-KI小鼠，采用阿尔新蓝-茜素红全骨架染色，研究IDH1突变如何影响软骨细胞的分化功能。结果:IDH1突变是软骨肿瘤中常见的遗传学改变；IDH1 R132H位点突变之后，细胞分泌的2-HG浓度显著增高；加入成骨细胞分化诱导液之后，胚胎间充质干细胞能够向成骨细胞分化，而当IDH1 R132H位点突变后，干细胞无法正常分化；IDH1突变小鼠的软骨细胞中，软骨分化标志性分子Sox9和Col-II基因表达无差异，然而软骨细胞肥大标志性分子Runx2和Col-X基因表达显著高于野生组小鼠，利用5 mmol/L的2-HG刺激模拟IDH1突变，得到相似结果；IDH1-KI小鼠整个骨骼中软骨含量明显增多，且有明显的骨化异常。结论:IDH1突变促进了软骨细胞的生长，抑制了软骨到成骨的分化过程。

关键词：
IDH1突变
原发性骨肿瘤
异柠檬酸脱氢酶-1
软骨分化
软骨肿瘤
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软骨肿瘤是常见的原发性骨肿瘤，分为软骨良性肿瘤和软骨恶性肿瘤。根据频发或特异的驱动基因变异可以对软骨肿瘤进行分子分型，从而更精准地指导临床诊疗[1]。近年来的研究发现，异柠檬酸脱氢酶-1(IDH1)突变是多种肿瘤的重要遗传学改变，并与肿瘤发生密切相关。IDH1突变常见于胶质瘤[2]、软骨肉瘤[3]、急性髓系白血病[4]等，已经成为胶质瘤、软骨肿瘤等鉴别诊断中的一项客观的诊断指标。约80%以上的IDH1突变位点是132位的精氨酸突变为组氨酸，即IDH1(R132H)突变。此外，还有R132C、R132S、R132G、R132L突变等[5]。IDH是三羧酸循环的关键酶，能够催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸(α-KG)[6],而突变的IDH蛋白具有新的酶活性，能够催化α-KG生成2-羟基戊二酸(2-HG)[7]。目前普遍认为，IDH突变产生的2-HG是一种癌代谢物，能够通过竞争性阻断α-KG依赖的反应，导致表观遗传异常，参与肿瘤的发生发展[8]。但是，IDH1突变在软骨肿瘤发生过程中的具体作用与机制，以及对肿瘤生物学行为的影响仍有待深入的研究。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本收集

收集2012至2022年经我院病理科诊断为软骨肿瘤的石蜡标本共74例。所有病例均经两位主治以上病理医生复诊并明确组织学诊断。本实验已通过医院伦理委员会同意。

1.1.2 实验动物

SPF级C57雄鼠30只，体质量(30±5)克，购于空军军医大学实验动物中心。IDH1 R132H突变(IDH1LSL-R132H/+)小鼠是加拿大安大略肿瘤研究中心(OCI)/玛格丽特公主医院TAK W.MAK教授惠赠。Col2a-Cre小鼠购于赛业生物。

1.2 试剂

小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection, ATCC);DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa; 茜素红，阿利新蓝均购自Sigma; 2-HG检测试剂盒购自abcame; 嘌呤霉素，PEI转染试剂，Polybrane溶液均购自MCE公司；胶原酶IV型购自上海生工；成骨细胞分化诱导液购自Gibco。

1.3 方法

1.3.1 人基因组DNA提取、PCR扩增及Sanger测序

在收集的石蜡标本中选取肿瘤组织丰富的蜡块，参照DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，Nanodrop-2000检测浓度和纯度，-20 ℃保存。IDH1基因突变检测，用上游引物5'-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3',下游引物5'-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3',对包含IDH1基因R132位点编码基因的DNA进行PCR扩增。引物合成及PCR产物测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成，使用Chromas软件分析测序图。

1.3.2 实时定量 PCR

Trizol法提取动物细胞中总RNA,Nanodrop-2000核酸定量仪确定浓度和纯度。按照反转录试剂盒规范操作方法，将RNA反转录为cDNA。按照实时定量PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，扩增，反应条件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 35 s, 循环40次；72 ℃ 10 min。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct 法计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.3.3 原代软骨细胞的培养

取胚胎期16.5 天小鼠的后肢生长板软骨，眼科剪将其剪碎至1 mm3大小，PBS洗3次，加入3 mg/mL IV型胶原酶，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中消化45分钟，150目不锈钢网过滤，1 000 r/min离心5分钟。弃上清，加入含等体积分数10%胎牛血清的完全培养基，将细胞悬液接种于培养皿中，置于 37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养4 d, 按照1∶3消化传代。

1.3.4 阿尔新蓝-茜素红全骨架染色

取胚胎期18.5天胎鼠，将小鼠皮肤和内脏去除干净，95%乙醇中固定5天。在配置好的0.015%阿尔新蓝染色工作液中浸泡3天，直至软骨组织被染成蓝色。中间可更换新鲜的染液。梯度乙醇水化平衡标本，用1% 氢氧化钾溶液处理1～2天，直到组织变得清透。然后用0.1%茜素红/1%氢氧化钾溶液处理2～3天，直到骨组织染成红色。最后用1% 氢氧化钾溶液清洗样品，再用20%甘油/1%氢氧化钾溶液处理样品，至骨架清晰可见。标本可长期保存于纯甘油中。

表1 PCR引物序列

1.3.5 慢病毒包装和转染方法

待293T细胞汇合到70%～80%时包装病毒。将慢病毒质粒、辅助包装质粒pAX2和pVSVG质粒按照4∶4∶3的比例加入到200 μL无血清培养基混匀。总质粒与 PEI比例为1∶4,采用等体积的无血清DMEM,稀释PEI溶液并静置5 min。将稀释的三质粒混合物质粒和PEI溶液1∶1混匀，室温孵育20 min, 加入含血清的培养液，混匀后加入培养皿中，37 ℃孵育细胞 48 h, 0.22 μmol/L滤器过滤收集病毒原液，-80 ℃保存。将被感染细胞接种于12孔板中，次日，用500 μL病毒原液、300 μL完全培养基和2.5 μL Polybrane稀释病毒后加到处理组细胞中。感染24 h后，即可以更换培养液。感染第3～5 天，用嘌呤霉素筛选细胞，使用筛选浓度处理细胞3～7天后，嘌呤霉素浓度降至50%,继续培养2周后，得到慢病毒稳转株和对照株。

1.4 统计学分析

计量资料均以均数±标准差

表示。数据分析采用t检验或单因素方差分析，P<0.05 表示差异具有统计学意义。采用 Graph Pad Prism 9.0 绘制统计图。

2、结果

2.1 IDH1突变是软骨肿瘤中常见的遗传学改变

收集经我院病理科诊断为软骨肿瘤的标本共74例，包括良性软骨肿瘤(内生软骨瘤15例，骨膜软骨瘤12例),恶性软骨肿瘤软骨肉瘤(中心型软骨肉瘤30例和去分化软骨肉瘤17例)。软骨肉瘤组织分级按WHO标准进行分类，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级。分析软骨肿瘤标本中IDH1(R132)位点的4种突变类型检测结果(图1),超过10%的软骨肿瘤患者存在IDH1突变(表2)。

图1 人软骨肿瘤标本中4种IDH1(R132)位点突变情况的测序结果图

2.2 IDH1突变抑制间充质干细胞向成骨细胞分化

诱导小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2向成骨细胞分化，转染IDH1 R132H突变的慢病毒，观察细胞分化情况。结果发现，IDH1 R132H突变之后，细胞分泌的2-HG浓度显著增高(P<0.01)(图2A)。加入成骨细胞分化诱导液之后，我们检测了成骨分化标志分子Acan和Col2a1证明成骨分化是否成功。正常情况下，加入成骨细胞分化诱导液之后，胚胎间充质干细胞能够向成骨细胞分化。当IDH1 R132H突变后，干细胞无法正常分化(P<0.01)(图2B)。

图2 IDH1突变后小鼠胚胎间充质干细胞无法向成骨细胞分化

2.3 IDH1突变小鼠软骨标志分子表达水平显著升高

分离野生型小鼠和IDH1LSL-R132H/+小鼠的软骨组织，Real-time PCR方法检测软骨分化标志分子Sox9和Col-II以及软骨细胞肥大标志分子Runx2和Col-X基因的表达水平。结果发现，软骨分化标志性分子Sox9和Col-II基因表达无差异，然而软骨细胞肥大标志性分子Runx2和Col-X基因表达显著高于野生组小鼠(P<0.01)(图3A)。利用5 mmol/L的2-HG刺激模拟IDH1突变，得到相似结果(P<0.05)(图3B)。

表2 人软骨肿瘤标本中IDH1 (R132)位点突变情况的检测n(%)

图3 IDH1LSL-R132H/+突变小鼠软骨肥大标志分子表达水平显著升高

2.4 软骨组织特异性突变小鼠软骨向成骨的分化受到抑制

为了研究突变的IDH1如何影响软骨细胞的分化功能，我们将IDH1LSL-R132H/+小鼠与Col2a-Cre小鼠交配，构建软骨组织特异性突变的IDH1LSL-R132H/+小鼠(IDH1-KI)。结果发现IDH1-KI小鼠出生后死亡，因此我们在胚胎期18.5天取胎鼠进行骨架染色分析。利用茜素红主要是染成骨组织(红色),阿尔新蓝主要是染软骨组织(蓝色),对小鼠骨架进行了染色。结果显示，与对照组小鼠相比，IDH1-KI小鼠整个骨骼中软骨含量明显增多，且有明显的骨化异常(图4),提示IDH1突变影响了软骨到成骨的分化，从而促进了软骨肿瘤的发生。

图4 IDH1-KI小鼠软骨组织显著增多

3、讨论

异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸循环中的一种关键酶，可催化异柠檬酸的氧化脱羧反应，广泛参与氨基酸代谢、脂代谢和糖代谢过程[9]。IDH的主要作用是催化异柠檬酸生成为α-KG,并同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)[10]。目前发现的与肿瘤发生发展高度相关的IDH家族成员主要有IDH1和IDH2。IDH1绝大多数的突变发生在第132位的精氨酸活性位点(R132),其中以精氨酸突变组氨酸(R132H)最为常见。由于R132处于IDH1活性位点中心，这个位置的突变能够改变IDH1的酶活性。IDH1突变后获得了新的酶活性，能够催化α-KG生成2-HG,并消耗大量的NADPH。2-HG作为癌代谢物，能够竞争性抑制α-KG依赖的DNA和组蛋白去甲基化修饰过程，改变表观遗传学，参与肿瘤的发生[11]。

近年来的研究发现，IDH1突变存在于多种软骨良性肿瘤和恶性肿瘤中[12,13]。我们在软骨肿瘤中也发现了IDH1的广泛突变，包括IDH1-R132L,IDH1-R132G,IDH1-R132C和IDH1-R132H突变，并且超过10%的软骨肿瘤患者都存在IDH1突变。有研究表明，小鼠间充质细胞系C3H10T1/2表达IDH2 R172K突变可引发低分化肉瘤的形成[14]。在细胞培养实验中，我们向小鼠间充质细胞系转染了IDH1 R132H突变的慢病毒，发现IDH1突变的细胞中2-HG的含量显著升高，并且IDH1突变确实抑制了间充质干细胞向成骨细胞分化。另外，无论是IDH突变或者额外的添加2-HG刺激，都会引起软骨细胞的肥大表型。像这样的肥大软骨细胞持续存在可能会残留在生长板骨末端附近，从而形成内生型软骨瘤。由于软骨组织特异性突变的IDH1-KI小鼠出生后死亡，我们只能研究胚胎期小鼠。胚胎期小鼠骨架染色结果发现，IDH1-KI小鼠骨骼中软骨含量明显增多，且有明显的骨化异常，表明IDH1突变小鼠软骨到成骨的分化受到抑制。这一发现与之前在基因修饰小鼠中的研究，Gli2转录激活抑制软骨细胞的分化，形成良性的内生软骨瘤，有着类似的表型[15]。因此，我们推测2-HG含量增加持续刺激生长板软骨细胞，抑制了软骨到成骨的分化，导致形成了内生软骨瘤。

综上所述，尽管IDH1突变存在于多种软骨肿瘤中，IDH1突变在小鼠也存在软骨瘤样病变，但是并非是恶性的软骨肉瘤，提示我们IDH1突变很可能是良性内生性软骨瘤形成早期的重要致病因素，如果要达到恶性肿瘤的进展应该还需要另外的诱导刺激。软骨肿瘤中IDH的高突变率，使IDH突变靶向治疗成为可能，抑制IDH突变后2-HG的水平，可能成为IDH1突变靶向治疗的一种方法，以提高软骨肉瘤患者的预后。

参考文献:

[1]王睿峰,郭卫.软骨肿瘤异柠檬酸脱氢酶基因突变的研究进展[J].中华骨与关节外科杂志,2021,16(2):155-160.

基金资助:国家自然科学基金课题项目资助(编号:82173120); 陕西省自然科学基础研究计划项目资助(编号:2022JM-536);

文章来源:袁媛,高星,杨莹,等.IDH1突变通过影响软骨分化促进软骨肿瘤的发生[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2359-2363.