宫颈癌(cervical cancer)是全球常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居女性生殖道恶性肿瘤第一位，严重危害妇女的健康与生命[1]。化疗是治疗宫颈癌的重要手段之一，据美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)公布的2024年第1版《NCCN子宫颈癌临床实践指南》报道，顺铂(cisplatin, DDP)是宫颈癌的标准一线化疗用药[2],但其疗效与毒副作用均随给药剂量的增加而增加[3]。妇瘤科临床工作中，因为DDP的严重化疗反应而被迫减量或终止化疗的情况时有发生。因此，寻找减轻DDP毒副作用及增加疗效的药物和方法亟待开发。

近年来研究表明，电压门控钾离子通道Kv10.1(ether-à-go-go-1,又称Eag1、KCNH1)在包括宫颈癌在内的多种肿瘤中过量表达，并与肿瘤的发生发展密切相关，而抑制Kv10.1的表达可以减缓肿瘤在体内外的增殖。Kv10.1通道在肿瘤中所起的重要作用使其成为肿瘤诊断的潜在标志物及治疗靶点[4]。本课题组于2019年报道Kv10.1通道特异性抑制剂粉防己碱(tetrandrine, TET,又名汉防己甲素)通过与Kv10.1直接作用，可以抑制宫颈癌细胞的增殖及荷瘤小鼠的肿瘤生长[5]。

基于以上基础，本研究拟探索Kv10.1在宫颈癌及正常宫颈中的表达情况，并将TET与DDP联合应用，观察其对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响，以期达到DDP减量增效的效果，并探讨其可能的作用机制，为探索宫颈癌新的临床化疗模式提供部分理论依据 。

1、资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料

30例宫颈癌组织和20例正常宫颈组织收集自2019年01月至2020年12月就诊于我院实施手术的患者，所有患者均有完整的临床病理资料。本研究通过天津市肿瘤医院医学伦理委员会审批。

1.1.2 宫颈癌细胞系

本实验所用宫颈癌细胞系(SiHa)由本研究实验室长期保存。

1.1.3 主要试剂

顺铂注射液(购自绿叶制药公司);粉防己碱标准品、DMEM培养基、MTT、Western Blotting ECL化学发光法检测试剂盒、Trizol试剂、反转录试剂盒(购自北京Solarbio公司);PI细胞周期检测试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、Matrigel基质胶、RNA提取试剂盒(购自碧云天公司);兔抗人Kv10.1、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、β-tubulin和β-actin抗体(购自华安生物公司);PI3K激动剂740Y-P(购自美国MCE公司);Transwell小室(购自美国康宁公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色

石蜡包埋组织4 μm连续切片、脱蜡、水化，PBS洗3次后，加入10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液高温高压修复抗原，冷却后PBS洗涤3次，加入50 μL 1∶250稀释的Kv10.1兔抗人多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温后，PBS洗涤3次，加二抗，1 h后用PBS洗涤3次，DAB-H2O2显色，PBS冲洗后用苏木素复染，酒精、二甲苯脱水，最后封片镜检。未加一抗者为阴性对照。

评分方法参照MELLO等[6]的方法，以细胞质膜出现棕黄色为阳性细胞，在光学显微镜200倍的视野下，对每张切片具有代表性的肿瘤区域随机选择5个视野，根据阳性细胞数目以及染色强度将评分定义为：0(阴性),1分(弱阳性),2分(阳性),3分(强阳性)。其中0分为<10%的细胞染色阳性，1分为>10%的细胞弱阳性染色，2分为>10%的细胞中等阳性染色，3分为>10%的细胞强阳性染色。0～1分为低表达，2～3分为高表达。

1.2.2 细胞培养

复苏冻存的SiHa细胞，接种于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，待细胞贴壁饱和至适当密度后使用胰蛋白酶消化，并以1∶1的比例传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3 MTT实验检测细胞增殖能力

消化收集处于对数期生长的SiHa细胞， 制备1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μL,边缘孔加入PBS,培养过夜。将含不同浓度药物的培养基加入96孔板，每组6孔，各组浓度如下：TET:1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL;DDP:0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL;取TET各浓度与DDP各浓度联合用药，另 设空白对照组。细胞处理24 h后，每孔加入 5 mg/mL MTT溶液20 μL, 孵育4 h后弃上清，每孔加入200 μL DMSO,避光低速震荡20 min溶解结晶，用酶标仪检测490 nm处的光密度(optical density, OD)值，计算细胞增殖率=(OD加药组-OD调零孔)/(OD对照组-OD调零孔)×100%,绘制细胞增殖抑制曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期

消化收集处于对数生长期的SiHa细胞，制备为2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2 mL,培养24 h, 加入 含不同浓度药物的培养基，各组浓度如 下：TET 20 μg/mL、DDP 25 μg/mL、TET 20 μg/mL+DDP 12.5 μg/mL、空白对照组。处理细胞24 h后收集细胞，胰酶消化后移至离心管，1 500 r/min离心5 min, 加入1 mL预冷的PBS洗涤1次，1 500 r/min离心5 min, 加入1 mL预冷的70%乙醇，4 ℃固定12～24 h; 1 500 r/min离心5 min, 加入1 mL预冷的PBS洗涤1次，每管样品中加入0.5 mL配好的碘化丙啶染色液(含25 μL 20× 碘化丙啶染色液，10 μL 50×RNase, 0.535 mL final volume),吹打重悬，37 ℃避光水浴30 min, 4 ℃避光存放，利用流式细胞仪在488 nm处记录荧光，分析细胞周期分布及凋亡情况。

1.2.5 Western Blot 分析蛋白表达

细胞处理方法同1.2.4节，处理细胞24 h后收集细胞。取4 ℃预冷的PBS轻轻润洗两遍，用蛋白裂解液裂解细胞后，离心去细胞碎片，收集上清。使用BCA蛋白定量试剂盒测定各组蛋白质浓度并确定上样体积后，100 ℃ 10 min水浴变性。上样于10%SDS-PAGE 中电泳分离蛋白质，电泳结束后将蛋白300 mA恒压湿转至0.2 μm PVDF膜上，8%的脱脂牛奶室温封闭1 h, 将膜与稀释后的Kv10.1、β-tubulin的一抗在4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min, 加入二抗室温摇床孵育1.5 h, TBST 洗膜 3次，每次10 min, ECL发光液浸泡后进行曝光，β-tubulin作为内参，使用Image J分析每个条带的灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.2.6 克隆形成实验检测细胞生长

消化收集处于对数生长期的SiHa细胞，制备为2×103个/mL 的细胞悬液，接种于6孔板中，加入含不同浓度药物的培养基，各组浓度如下： TET 20 μg/mL,740Y-P 25 μg/mL,TET 20 μg/mL+740Y-P 25 μg/mL。处理细胞10天后，弃去培养基，4%多聚甲醛固定20 min, 0.1%结晶紫染色20 min, 光学显微镜拍照并计数。

1.2.7 Transwell检测细胞侵袭

向Transwell上室中铺50 μL 由无血清DMEM培养基稀释的Matrigel基质胶，37 ℃凝胶4 h。 细胞处理方法同 1.2.6节，将各组细胞消化制成1×104个/mL的细胞悬液，向 上室接种细胞悬液200 μL,下室加入完全培养基 800 μL,37 ℃培养箱中培养16 h。用PBS清洗上室，1 mL 4%多聚甲醛固定20 min, PBS清洗两次，0.1%结晶紫染色20 min。清洗小室，用棉签擦去上室细胞。完全干燥后，用显微镜随机选取5个视野拍照并计数。

1.2.8 细胞划痕实验检测细胞迁移

消化收集处于对数生长期的SiHa细胞，制备为2×106个/mL的细胞悬液，接种于6孔板中，待细胞融合达90%时，用枪头垂直划线，PBS清洗漂浮细胞。向6孔板中加入含不同浓度药物的无血清培养基，细胞分组同1.2.6节，用显微镜分别于0 h、24 h、48 h 对同一部分划痕的愈合情况进行拍照，使用Image J 计算划痕面积，细胞迁移率 =(0 h 划痕面积-12 h/24 h 划痕面积)/0 h 划痕面积。

1.2.9 实时荧光定量PCR检测细胞Kv10.1表达

细胞处理方法同1.2.6节，收集处于对数生长期的细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA,紫外分光光度计检测浓度，反转录合成cDNA。Kv10.1上游引物： 5'-TGCCAACACCAACAGATACCA-3',下游引物：5'-CCATTACTCGCTCACTCAATCC-3'。PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环，72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳显示结果，通过凝胶成像分析仪分析条带光密度。

1.3 统计学方法

所有实验均进行3次独立实验，采用SPSS 25.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 9.0进行图像绘制，计数资料以n(%)表示，采用卡方检验；多组间数据分析采用多因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Kv10.1在宫颈癌组织中表达升高

免疫组化染色结果显示，Kv10.1染色呈棕黄或棕褐色，主要表达于细胞膜质(图1)。30例宫颈癌组织中，Kv10.1阳性表达25例，阳性表达率为83.33%,而在20例正常宫颈组织中，Kv10.1阳性表达仅2例，阳性表达率为10.00%,Kv10.1在宫 颈癌组织中的 阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

图1 Kv10.1在宫颈组织中的表达(SP×200)

表1 Kv10.1在宫颈癌组织与正常宫颈组织中的表达情况n(%)

2.2 TET与DDP对宫颈癌SiHa细胞的增殖抑制作用

与对照组相比，不同浓度的TET(1、3、10、30 μg/mL)或DDP(0.05、0.5、5、50 μg/mL)均能抑制SiHa细胞的增殖，并呈浓度依赖性。当TET与DDP联合用药时，与TET或DDP单用组相比，药物联用组对细胞的抑制作用更显著，各组细胞抑 制率均随着药物浓度的增加而增加，呈现出剂量依赖性。 经计算，TET的IC50为19.99 μg/mL,DDP的IC50为21.97 μg/mL,联合用药组的IC50分别为14.080 μg/mL、5.798 μg/mL、0.052 9 μg/mL、0.009 μg/mL,与单药组相比，联合用药组IC50 均显著低于两药单独作用浓度 (图2,P<0.05 )。这些结果表明，TET能增强DDP对宫颈癌SiHa细胞的增殖抑制作用。

图2 TET、DDP单药及联合用药对SiHa细胞增殖的影响

2.3 TET与DDP对宫颈癌SiHa细胞生长的影响

如图3所示，细胞周期的检测结果显示，与对照组相比，用药各组S期细胞比例均降低，其中TET+DDP组最为显著，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。细胞凋亡的流式检测结果显示，与对照组相比，TET和DDP干预各组凋亡率均明显增加(P<0.005)。而与单药组相比，TET和DDP联合用药组凋亡率显著增加， 差异具有统计学意义(P<0.000 5)。结果表明，TET和DDP均能促进SiHa细胞阻滞在S期，并诱导其凋亡，且TET与DDP联用时作用更显著。

图3 TET、DDP单药及联合用药对SiHa细胞周期的影响

2.4 TET 与DDP对宫颈癌SiHa细胞中 Kv10.1及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

Western Blot结果显示(图4),TET单独或与DDP联合处理细胞后，SiHa细胞中 Kv10.1、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平较对照组明显降低，差异具有统计学意义 (P<0.005)。这些结果提示，TET可能通过抑制Kv10.1和PI3K/Akt信号通路增强SiHa细胞对DDP的敏感性。

图4 TET、DDP单药及联合用药干预SiHa细胞后相应标志物的蛋白水平变化

2.5 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞增殖的抑制作用

如图5所示，与TET组相比，TET+740Y-P组克隆细胞数量明显增多；与740Y-P组相比，TET+740Y-P组克隆细胞数量明显减少(P<0.05)。

图5 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞增殖的抑制作用(*P<0.05,***P<0.000 5)

2.6 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞侵袭的抑制作用

如图6所示，与TET组相比，TET+740Y-P组克隆细胞的穿膜细胞数量明显增多；与 740Y-P组相比，TET+740Y-P组克隆细胞的穿膜细胞数量明显减少(P<0.000 1)。

图6 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞侵袭的抑制作用(结晶紫染色×100)(****P<0.000 1)

2.7 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞迁移的抑制作用

如图7所示，与TET组相比，TET+740Y-P组划痕愈合率明显增高；与740Y-P组相比，TET+740Y-P组划痕愈合率明显下降(P<0.01)。

图7 激活PI3K/Akt信号通路逆转TET对SiHa细胞迁移的抑制作用

2.8 激 活PI3K/Akt信号通路影响SiHa细胞Kv10.1的表 达

如图8所示，TET+740Y-P组的Kv10.1的表达水平高于TET组，低于740Y-P组(P<0.01)。

图8 RT-PCR检测各组Kv10.1的水平

3、讨论

宫颈癌的治疗手段包括手术、放化疗及免疫治疗等，近年来各种治疗手段的进步使各期患者的生存率有了显著提高，但晚期宫颈癌患者的死亡率仍然很高，5年生存率仅为16.5%[7]。对于术后有高危因素的患者、晚期及复发转移的宫颈癌患者来说，化疗依然是不可或缺的治疗手段，且目前晚期宫颈癌的化疗临床研究，如JCOG0505等，仍以铂类为用药基础[8]。DDP是宫颈癌治疗的一线化疗药物，能与肿瘤细胞的DNA结合，阻止DNA复制，达到抗肿瘤的作用，对各细胞周期的肿瘤细胞均有作用，具有广泛的抗肿瘤活性。然而，DDP具有肾毒性、耳毒性、骨髓抑制等毒副作用，以及长期大量使用导致的耐药性，这些使DDP的临床应用受到极大的限制，直接影响宫颈癌的化疗效果[9,10]。

定位于染色体1q32-41的电压门控钾离子通道 Kv10.1,是电压门控钾离子通道KCNH基因家族成员，在多种恶性肿瘤中表达，并在肿瘤的发生发展过程中起到重要的作用，文献报道Kv10.1在宫颈癌中的表达率约为78%[11]。我们的实验结果同样发现Kv10.1在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈上皮。既往研究认为Kv10.1可能会通过影响细胞异常增殖、调控细胞周期[12]等机制影响肿瘤的发生发展。TET作为一种天然中药小分子，多项研究表明其可以有效抑制肿瘤细胞生长，逆转多药耐药，并可减轻放疗的不良反应等[13,14]。本课题组于2019年报道，TET可作为Kv10.1通道的特异性抑制剂，通过与Kv10.1的直接相互作用，进而在体内外实验中均可抑制宫颈癌的生长，对荷瘤小鼠肿瘤的抑制率达64.21%,并且无明显的毒副作用[5]。在本研究中，我们观察并分析了TET与DDP联合用药对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响。结果显示，TET与DDP对SiHa细胞均具有一定的抑制作用，且呈浓度依赖性，而相比于二者的单独用药，TET和DDP联合用药不仅抑制了宫颈癌细胞的增殖，还显著促进G0/G1期细胞阻滞和凋亡。这些发现提示，TET有利于增加宫颈癌细胞对DDP化疗的敏感性，为实现DDP减量增效提供参考。

PI3K/Akt是酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的主要下游分子，Akt是PI3K的关键信号转导因子和调节细胞生长的致癌基因。Akt磷酸化被激活后，其下游底物蛋白促进细胞增殖，而磷酸化被抑制后则诱导细胞凋亡[15]。因此PI3K/Akt信号通路被抑制可调控多种癌细胞的凋亡。本实验证实了TET可明显降低SiHa细胞PI3K和Akt的磷酸化水平，提示TET抑制了PI3K/Akt通路，而激活PI3K/Akt可以逆转TET对SiHa细胞的抑制作用，并影响Kv10.1的表达，提示TET可能通过抑制PI3K/Akt途径，降低Kv10.1的表达，从而抑制宫颈癌细胞的生长，并增加宫颈癌细胞对DDP的敏感性。

综上所述，TET可通过抑制PI3K/Akt信号通路，下调Kv10.1的表达水平，协同顺铂抑制宫颈癌细胞增殖并诱导其凋亡。TET与DDP联合应用增强了DDP的抗癌疗效，同等疗效下可以降低DDP的用药剂量，减少了化疗毒性。因此，采用中药小分子TET联合DDP治疗可能成为宫颈癌治疗的新思路。

参考文献:

[10]毛万丽,李杰慧,冉立.宫颈癌顺铂耐药研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(16):2927-2932.

[13]辛国松,王毛毛,侯妍秀,等.基于Hippo/YAP信号通路探究粉防己碱抗乳腺癌耐药机制 [J].中草药,2023,54(18):5960-5967.

基金资助:天津市科技计划项目(编号:20JCZXJC00100); 天津市教委科研计划项目(编号:2019ZD033); 天津市医学重点学科(专科)建设项目(编号:TJYXZDXK-009A);

文章来源:王博畅,刘文欣.粉防己碱联合顺铂抑制宫颈癌细胞生长的作用和机制研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2364-2370.