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JAK抑制剂巴瑞替尼抗斑秃急性和慢性体内药效学研究

2024-09-20 87 上传者：管理员

摘要：目的评价巴瑞替尼对小鼠斑秃的体内药效，为相关JAK抑制剂的临床前体内药效学评价提供参考。方法利用斑秃相关炎症因子白细胞介素2（IL-2）刺激小鼠血清干扰素-γ（IFN-γ）产生建立急性药效学模型，快速评价巴瑞替尼的体内抗炎活性；利用咪喹莫特诱导C3H/HeJ小鼠建立斑秃模型，通过斑秃严重程度评分、脾脏指数、组织病理学检查以及免疫荧光染色表征浸润炎症细胞的变化，评价巴瑞替尼对斑秃的治疗作用。结果与模型组相比，巴瑞替尼可剂量依赖性地抑制血清IFN-γ产生；咪喹莫特可诱导C3H/HeJ小鼠产生严重的斑秃，巴瑞替尼能有效抑制小鼠斑秃的疾病进展，抑制全身性炎症引起的脾脏肿大，改善毛囊周围CD4+T和CD8+T细胞浸润，同时显示出对毛囊周期的促进作用。结论巴瑞替尼在体内具有强大的抗炎活性，可能通过减少皮肤中T细胞浸润和促进毛囊生长周期，改善斑秃进展。

关键词：
JAK/STAT通路
JAK抑制剂
急性/慢性药效学模型
斑秃
无瘢痕性脱发
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斑秃(AA)是一种T细胞介导的自身免疫性和无瘢痕性脱发，全球有多达1.47亿人受到斑秃的影响[1]。斑秃的治疗方法很少，其传统的治疗方法对重症患者的耐受性和疗效各不相同，且未经美国食品药品监督管理局(FDA)批准，属于超说明书用药[2]。促炎细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和细胞因子γ链(γc)通过Janus激酶(JAK)以及信号转导和转录激活因子(STAT)发出信号，介导毛囊失去免疫赦免和炎症放大，是斑秃的重要驱动因素[3]，这为靶向JAK治疗斑秃提供了理论基础[4]。

2022年6月13日，FDA宣布批准JAK抑制剂巴瑞替尼(baricitinib)的新适应证，用于治疗成人重度斑秃[5]。这不仅是FDA批准的首款口服斑秃药物，也是JAK抑制剂治疗斑秃研究领域的重大突破。本研究根据斑秃的发病机制和病理特征，在体内急性和慢性药效学评价体系上，考察巴瑞替尼对斑秃小鼠的治疗作用，以期为抗斑秃药物的开发提供参考。

1、材料

1.1试药

巴瑞替尼(货号：HY-15315，纯度：99.70%，MCE)；鼠源白细胞介素(IL)-2(货号：CK24，规格：10μg，上海近岸蛋白科技有限公司)；小鼠IFN-γ高敏ELISA试剂盒(货号：EK280HS-01，杭州联科生物)；甲基纤维素(货号：M0512，Sigma-Aldrich)；咪喹莫特乳膏(货号：40230603，规格：3 g/支，四川明欣药业)；CD4和CD8抗体(货号：ab183685和ab217344，Abcam)。

1.2动物

SPF级雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重18～22 g[北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008]；SPF级雄性C3H/HeJ小鼠，7～8周龄，体重23～26 g[百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(苏)2021-0005]。饲养于中国科学院上海药物研究所实验动物中心，常规饮食，全天自由饮用湿热灭菌超纯水，全程保持恒温恒湿，温度在24.6℃左右，湿度在55.5%左右，人工光照保证每日白昼和黑夜各12 h。动物实验经过伦理委员会批准并按照动物福利和伦理要求操作，IACUC申请号：2023-01-LJ-137。

1.3仪器

Thermo Fisher D1193纯水仪(Thermo Scientific)；Centrifuge 5417R台式离心机(Eppendgorf)；SPECTRA max Pro酶标仪(Molecular Devices)；多光谱组织成像分析仪(PE Vectra3)。

2、方法

2.1药物配制

称取甲基纤维素粉末加入生理盐水配制为0.5%甲基纤维素(0.5%甲基纤维素)溶液；IL-2冻干粉用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解至5μg·mL-1，临用现配；称取适量巴瑞替尼粉末用0.5%MC溶液制成所需浓度。

2.2巴瑞替尼对IL-2诱导BALB/c小鼠IFN-γ影响的研究

2.2.1分组及给药

雄性BALB/c小鼠，体重18～22 g，根据小鼠体重，随机分为5组：正常组，模型组，3、10和30 mg·kg-1巴瑞替尼组，每组6只。在造模前1 h，正常组(Control)和模型组(Vehicle)给予巴瑞替尼溶媒(0.5%甲基纤维素)，治疗组分别给予3、10和30 mg·kg-1巴瑞替尼干预，单次给予，灌胃给药。

2.2.2造模及血清IFN-γ含量检测

灌胃相应药物1 h后正常组腹腔注射PBS对照，其他组小鼠腹腔注射1μg IL-2造模。6 h后用2%～3%异氟烷和氧气(1～2 L·min-1)混合气体吸入麻醉小鼠后取血，1000g离心10 min，分离血清，利用小鼠IFN-γ高敏ELISA试剂盒检测小鼠血清IFN-γ含量。

2.3巴瑞替尼对咪喹莫特乳膏诱导C3H/HeJ小鼠斑秃治疗作用的研究

2.3.1造模分组及给药

雄性C3H/HeJ小鼠，体重23～26 g，根据小鼠体重，随机分为5组：正常组，模型组，3、10和30 mg·kg-1巴瑞替尼组，每组6只。用2%～3%异氟烷和氧气(1～2 L·min-1)混合气体吸入麻醉后，用医用棉签蘸取咪喹莫特乳膏，均匀涂抹至颈部皮肤1 cm×1 cm，每周4次，持续1周，操作中动作尽量轻柔，涂抹均匀。4个处理组涂抹咪喹莫特乳膏造模，正常组涂抹白凡士林。

正常组和模型组给予溶媒(0.5%甲基纤维素)，治疗组分别给予3、10和30 mg·kg-1巴瑞替尼干预，在咪喹莫特乳膏造模1 d前(0 d)开始，每日一次，灌胃给药，持续17 d。

2.3.2小鼠斑秃模型的药效学评价指标

斑秃评分：从4次咪喹莫特乳膏造模结束后(第8日，避免咪喹莫特乳膏粘连毛发造成评分偏差)开始，每日观察动物项部斑秃严重程度并进行盲法评分，一直持续到实验结束。斑秃严重程度评估根据脱发工具(SALT)[6]进行评分：0分，无脱发；1分，未出现明显斑秃，但毛发零散、松动，排列紊乱，轻微摩擦即发生脱落；2分，斑秃明显且面积小于25%；3分，斑秃面积为25%～75%；4分，斑秃面积大于75%。

器官受累程度检测：实验结束，取小鼠脾脏称重，以脾脏指数表征小鼠器官受累程度。具体计算方式如下所示：脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)。

皮肤病理学检查：取小鼠斑秃处皮肤置于4%甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE染色以便镜检，观察毛囊形态和长度变化。

皮肤内CD4+T和CD8+T细胞免疫荧光染色检测：在皮肤切片上对CD4+T和CD8+T细胞进行免疫荧光染色，并使用HALO软件的HighPlex FL模块对阳性细胞进行定量。

2.4统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计作图，结果以均值±标准差表示，多组间数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1巴瑞替尼对IL-2刺激BALB/c小鼠血清IFN-γ的影响

与正常组相比，腹腔注射IL-2刺激，小鼠血清中IFN-γ含量显著增加；与模型组相比，造模前1 h给予巴瑞替尼3、10和30 mg·kg-1干预可剂量依赖性地降低小鼠血清IFN-γ含量(见图1)。

图1巴瑞替尼对IL-2刺激的小鼠中IFN-γ的影响(

3.2巴瑞替尼对喹莫特乳膏诱导的斑秃的治疗效果

3.2.1小鼠斑秃严重程度评分

咪喹莫特乳膏诱导可使C3H/HeJ小鼠发生与临床相似的斑秃表现，造模部位最初表现为毛发紊乱、松动，而后自发片状脱落，裸露部位皮肤外观正常、无萎缩，未见瘢痕、红斑硬结和皮肤异色等现象，巴瑞替尼可缓解疾病进展(见图2)。与正常组相比，模型组小鼠项部斑秃评分显著增加(见图3A)；与模型组相比，给予巴瑞替尼可剂量依赖性地降低C3H/HeJ小鼠斑秃严重程度评分，3、10、30 mg·kg-1巴瑞替尼对斑秃严重程度评分曲线下面积(AUC)的抑制率分别为47.67%、43.41%和54.39%(见图3B)。

3.2.2器官受累检测

整个实验周期，各组小鼠体重无显著变化(见图4A)。咪喹莫特乳膏诱导斑秃模型会引起不限于皮肤的全身性炎症反应，例如脾脏肿大；与模型组相比，巴瑞替尼可剂量依赖性地显著降低斑秃小鼠脾脏指数(见图4B)。

图2斑秃小鼠项部皮肤形态图片

Fig 2 Morphology photos of the neck skin of mice with alopecia areata

图3巴瑞替尼对咪喹莫特诱导模型小鼠斑秃严重程度的影响

图4巴瑞替尼对咪喹莫特诱导斑秃小鼠全身免疫反应的影响

3.2.3组织病理学检查

经HE染色可见，正常鼠皮肤内毛囊多数处于休止期，位于皮肤表皮层，颗粒层及棘层细胞数目少，角质层较薄；咪喹莫特乳膏诱导斑秃形成后，毛发脱落，毛囊开始向生长期过渡，毛乳头体积增大，向下生长，并穿过表皮层延伸至脂肪层，可见新生的内毛根鞘，明显进入生长期；对纵向形态毛囊的长度进行测量，与模型组相比，巴瑞替尼可剂量依赖性地显著增加斑秃小鼠毛囊长度(见图5)。

图5巴瑞替尼对咪喹莫特诱导斑秃小鼠皮肤组织(A，比例尺：100μm)及毛囊长度(B)的影响

3.2.4皮肤内CD4+T和CD8+T细胞免疫荧光染色检测

与正常组相比，模型组小鼠CD4+T和CD8+T细胞数量占总细胞的比例显著升高，且散在分布在毛囊周围；与模型对照组相比，巴瑞替尼可剂量依赖性地显著降低CD4+T和CD8+T细胞占比(见图6)。

图6巴瑞替尼对咪喹莫特诱导斑秃小鼠皮肤内CD4+T和CD8+T细胞数量的影响

4、讨论

斑秃是一种自身免疫性疾病，表现为无瘢痕性脱发，严重影响患者心理健康。据统计，脱发的全球患病率接近1.7%～2%，预计全球脱发市场规模将在2028年达到138亿美元[7]。近几年来，JAK抑制剂治疗斑秃十分火热，巴瑞替尼是一种JAK1/2抑制剂，已成为首个用于治疗成人重度斑秃的创新靶向药物[8]。后续有JAK抑制剂，如利特昔替尼近期获批治疗12岁以上斑秃患者[9]，以及Brepocitinib、CTP-543等处于临床Ⅲ期。巴瑞替尼是首款系统性治疗重度斑秃的靶向药物，但其临床前只有部分体外数据披露，体内数据未见报道，给JAK抑制剂的临床前开发造成了困扰。

本研究证实了巴瑞替尼在体内具有强大的抗炎活性。IL-2和IFN-γ等促炎细胞因子信号通路在斑秃患者和小鼠的病变皮肤中均显示出强烈的激活，其通过增强效应CD8+T细胞的功能和维持CD122记忆性T细胞的存活，从而介导毛囊的破坏[10]。本研究发现，在IL-2刺激小鼠血清IFN-γ产生的急性药效学模型中，巴瑞替尼单次给药后6 h即可显著降低血清IFN-γ含量。因此，巴瑞替尼可能通过抑制IL-2等γc细胞因子的下游信号转导，从而抑制斑秃相关炎症反应。

此外，本研究发现巴瑞替尼可抑制斑秃病灶皮肤中致病性T细胞的浸润，并显示出对毛囊生长的促进作用。病理性T细胞的激活和增殖介导了毛囊的破坏，是斑秃的重要驱动因素[4]。虽然斑秃的临床表现是局部的，但存在全身性炎症的迹象，致病性T细胞不仅存在于病灶皮肤中，还存在于脾脏和皮肤引流淋巴结中，表现为脾脏肿大[11]。本研究发现，巴瑞替尼改善斑秃的疾病进展与致病性T细胞的减少有关，其不仅显著降低了毛囊周围CD4+T和CD8+T细胞浸润，还抑制了全身免疫系统(降低脾脏指数)。同时，巴瑞替尼干预显示出对毛囊生长的促进作用，可能是其干扰了致病性T细胞对毛囊的攻击，使毛囊更快地恢复了生长周期。最近，Harel等[12]的研究也显示抑制JAK-STAT信号传导可通过促进小鼠毛囊进入生长期诱导毛发生长，这可能是促进毛囊生长的另一个重要因素。因此，巴瑞替尼改善斑秃表型的机制之一，可能与抑制致病性T细胞的浸润并促进毛囊生长有关。

本研究仍存在一些局限，JAK抑制剂治疗斑秃取得令人满意的效果，但大量患者停止治疗后复发[13]，其中皮肤驻留记忆性T细胞是斑秃复发的关键因素，其可以在治疗停止后再次将毛囊抗原暴露给免疫系统。本研究初步证实巴瑞替尼可抑制斑秃疾病进展中致病性T细胞的浸润，但并未对T细胞亚群进行区分，尚未考察耗竭记忆性T细胞对于斑秃进展的长久影响，JAK抑制剂诱导缓解后低剂量维持记忆性T细胞耗竭在临床上是否具有长期益处[14]，这还需要进一步的探索。

综上，本研究首次在动物水平上证实，JAK抑制剂巴瑞替尼在体内具有强大的抗炎活性，可通过抑制斑秃病灶皮肤中致病性T细胞的浸润和促进毛发生长周期，以改善斑秃疾病进展，这也为相关JAK抑制剂临床前体内药效学评价提供了参考。

文章来源:周卯,苏明波,王立辉.JAK抑制剂巴瑞替尼抗斑秃急性和慢性体内药效学研究[J].中南药学,2024,22(09):2281-2285.