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Xpert MTB/RIF检测极低菌量样本利福平耐药假阳性分析

2024-09-20 194 上传者：管理员

摘要：目的探讨Xpert MTB/RIF(Xpert)检测在极低菌量样本利福平耐药假阳性结果的原因。方法收集2017年6月至2021年3月武汉市肺科医院346例Xpert结果为结核分枝杆菌极低且利福平耐药的样本。根据扩增结果将样本分为探针延迟组和探针缺失组，进行结核菌培养和比例法药敏试验，对药敏结果不一致的菌株进行Xpert复检确认。结果共有195例样本培养结果为阳性，阳性率为56.36%(195/346)。经Xpert复检确认，64例Xpert耐药比例法敏感菌株中探针延迟组4.55%(1/22)的D探针和13.33%(2/15)的E探针存在突变，而探针缺失组75.00%(9/12)的A探针和80.00%(8/10)的E探针存在突变。探针延迟组和探针缺失组的Xpert利福平耐药假阳性比例分别为78.26%(36/46)和3.36%(5/149)。结论 Xpert检测极低菌量样本产生利福平耐药假阳性的主要原因是D探针和E探针的延迟，其次是A探针和E探针的低水平耐药突变。

关键词：
Xpert MTB/RIF
假阳性
利福平耐药
探针延迟
结核分枝杆菌
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2022年全球约有1 060万人感染结核病，其中130万人死于结核病[1]。结核病的早期诊断和有效治疗对于遏制结核病传播和实现“终止结核病”目标至关重要[2]。GeneXpert MTB/RIF(Xpert)可以快速检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)并评估其对利福平的耐药性[3]。世界卫生组织推荐使用Xpert进行结核病和利福平耐药性的快速筛查[4-5]。结核病患者一旦诊断为利福平耐药，则按照耐多药结核病方案治疗[6]。

Xpert检测利福平耐药结果根据扩增曲线可分为探针缺失和探针延迟。Xpert检测利福平耐药性结果准确可靠[7-9],但表现为探针延迟的利福平耐药结果存在较高的耐药假阳性，且主要为ΔCt 4.1-4.9[10-11]。Xpert在检测极低菌量样本时容易出现利福平耐药的假阳性结果[12-14]。但是探针延迟与Xpert检测极低菌量样本利福平耐药假阳性的关系，目前尚无相关研究。研究将Xpert检测MTB极低利福平耐药结果分为探针延迟组和探针缺失组分组分析，提高利福平耐药性报告的准确性。

1、材料与方法

1.1标本来源

收集2017年6月至2021年3月武汉市肺科医院患者Xpert检测结果为MTB极低利福平耐药样本346例，其中支气管肺泡灌洗液146例，痰液135例，分泌物36例，胸水22例，脑脊液4例，粪便2例，尿液1例。根据初次Xpert检测结果分为探针延迟组和探针缺失组。对收集到的样本进行分枝杆菌罗氏培养，培养阳性菌株进行比例法药敏试验，利福平耐药性结果不一致的菌株用Xpert检测确认。

1.2仪器与试剂

Xpert检测系统及其配套的前处理溶液和检测试剂盒均购自美国Cepheid公司，软件为G4版本5.0。中性罗氏培养基，酸性罗氏培养基，利福平药敏培养基均购自珠海贝索生物技术公司。

1.3方法

1.3.1 Xpert检测

按照检测试剂盒说明书进行。在待检样本中加入2倍的前处理液，漩涡震荡30 s,充分液化，静置15 min,用配套的一次性无菌吸管移取2 mL加入检测试剂盒，上机检测，仪器自动报告结果。根据探针最小Ct值判断MTB含量，最小Ct值>28.0,则报告MTB极低。扩增结果表现为探针延迟的利福平耐药为ΔCt >4.0,表现为探针缺失的利福平耐药为突变探针Ct值为0。

1.3.2罗氏培养

参照《结核病实验室检验规程》[15]进行。支气管肺泡灌洗液和尿液样本3 000g离心15 min,取沉淀进行样本前处理。痰液和分泌物样本直接进行前处理。样本前处理：在样本中加入2倍的4%NaOH溶液，漩涡震荡1 min,充分液化，静置15 min。样本前处理完成后，用一次性无菌吸管吸取中部液体接种酸性罗氏培养基，每支培养基接种100μL,均匀铺满培养基斜面。胸水和脑脊液样本3 000g离心15 min,取沉淀接种中性罗氏培养基。接种完成后，培养基置于37℃恒温培养箱孵育，每周观察记录菌落生长情况，培养8周后无细菌生长报告阴性。

1.3.3比例法药敏

参照《结核病实验室检验规程》进行。利福平药敏培养基的含药浓度为40μg/mL。培养4周后观察并报告药敏结果。

1.4统计学方法

采用Excel 2010和SPSS 26.0进行数据录入和处理。

2、结果

2.1突变探针类型

346例Xpert检测利福平耐药样本的探针突变类型中，探针延迟组91例(26.30%),探针缺失组例255例(73.60%)。探针延迟组的最小探针Ct值为30.78±1.03,而探针缺失组的最小探针Ct值为29.89±1.34。两组之间差异有统计学意义(t=6.55,P<0.01),表明探针延迟更容易发生在细菌载量较低、Ct值较高的样本中。在突变探针类型中，单探针突变占主导地位，其中E探针有187例(54.05%),D探针有81例(23.41%),A探针有32例(9.25%),B探针有29例(8.38%),C探针有2例(0.58%)。双探针突变中，BE探针有6例(1.73%),其他双探针突变的比例均<1%。

2.2利福平耐药性分析

346例样本培养结果、比例法药敏以及菌株Xpert复检结果(表1)。共有195例(56.36%)样本培养阳性。其中，探针延迟组的培养阳性率为50.55%(46/91),探针缺失组的培养阳性率为58.43%(149/255)。Xpert利福平耐药性与比例法结果不一致的共有64例(32.82%)。在探针延迟组和探针缺失组中，Xpert检测的利福平耐药假阳性分别为86.96%(40/46)和16.11%(24/149)。对64例利福平耐药结果不一致的菌株进行Xpert复检。其中，探针延迟组有4例检测出耐药，而探针缺失组有19例检测出耐药。在探针延迟组中，4.55%(1/22)的D探针和13.33%(2/15)的E探针存在突变；在探针缺失组中，75.00%(9/12)的A探针和80.00%(8/10)的E探针存在突变。最终，Xpert初次检测的利福平耐药假阳性在探针延迟组和探针缺失组分别为78.26%(36/46)和3.36%(5/149)。

2.3利福平耐药假阳性样本ΔCt分布

在探针延迟组的36例利福平耐药假阳性中，ΔCt值为4.1～5.0的占16例(44.44%),ΔCt值为5.1-6.0和ΔCt值>6.0的各有10例(27.78%)。

表1比例法药敏和Xpert复检结果

3、讨论

耐药结核菌株突变存在多样性[16],且有一定的近期传播率[17],早期诊断极为重要。错误的利福平耐药结果可能导致患者接受错误的治疗。世界卫生组织建议对利福平耐药的病例进行重新留样复检确认，以排除利福平耐药的假阳性结果[18]。低细菌负荷可能导致特定Xpert探针上的序列扩增不足，出现探针延迟[19]。此研究检测的极低菌量样本中探针延迟组和探针缺失组的最小Ct值之间存在显著差异，说明探针延迟更容易发生在细菌载量更低、Ct值更高的样本中。探针延迟主要出现在D探针和E探针上，分别占比47.25%(43/91)和45.05%(41/91)。在探针延迟组的36例利福平耐药假阳性中，ΔCt值在4.1～5.0的范围内的占比为16例(44.44%)。

以比例法药敏和菌株Xpert复检结果为参考，探针延迟组的利福平耐药假阳性率为78.26%(36/46),而探针缺失组的利福平耐药假阳性率为3.36%(5/149),表明探针延迟是Xpert检测极低菌量样本利福平耐药假阳性的主要原因。Xpert复检结果中，探针缺失组A探针缺失和E探针缺失样本复检耐药的占比分别为75.00%(9/12)和80.00%(8/10),可能与A探针和E探针的低水平耐药突变有关[20]。Xpert在检测利福平低水平耐药方面的能力要优于比例法药敏和最低抑菌浓度法[21]。

Xpert检测极低菌量样本产生利福平耐药假阳性的主要原因是D探针和E探针的延迟，其次是A探针和E探针的低水平耐药突变。结核病实验室工作人员在报告Xpert极低菌量利福平耐药结果时，应该查看扩增曲线。对于探针延迟的利福平耐药结果，需要与临床医生进行沟通，并在必要时重新采样进行检测[22-27]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

文章来源:饶有益,刘畅,辛秋丹,等.Xpert MTB/RIF检测极低菌量样本利福平耐药假阳性分析[J].公共卫生与预防医学,2024,35(05):24-27.