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基于多重荧光PCR法检测肺炎支原体耐药位点

2025-04-22 91 上传者：管理员

摘要：目的建立快速检测肺炎支原体耐药基因突变位点的荧光PCR方法，用于临床样本检测。方法基于肺炎支原体23S rRNA基因序列X68422.1，分别设计合成特异性检测A2063G、A2064G、C2617G等3个突变位点的荧光PCR引物和探针，建立同时检测肺炎支原体23S rRNA基因上3个耐药基因位点突变的多重荧光PCR法；合成标准质粒，验证建立的方法的敏感性、重复性和特异性。用建立的方法检测303份肺炎支原体核酸阳性临床样本，并通过一代测序对部分样本进行复核。结果建立的多重荧光PCR法对3个位点突变的检测限均为1拷贝/μl，未观察到交叉反应。检测303份肺炎支原体阳性临床样本，全部样本23S rRNA基因均存在A2063G突变，3份样本同时存在A2064G，所有样本均未检测到C2617G突变。结论建立的多重荧光PCR方法可同时检测肺炎支原体23S rRNA基因A2063G、A2064G、C2617G位点突变，可帮助临床医生选择合适的抗菌药物。

关键词：
呼吸道病原体
基因突变
多重PCR
耐药性
肺炎支原体
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肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)是一种常见呼吸道病原体,可引起中度上呼吸道感染､重度下呼吸道感染和肺外临床症状,如脑炎､史蒂文斯约翰逊综合征､心肌炎和溶血性贫血[1],是社区获得性肺炎(communityacquiredpneumonia,CAP)的主要病原体[1-2]｡学龄儿童和青少年中10%~40%的社区获得性肺炎来自肺炎支原体感染,成人中大约是4%~8%,在肺炎支原体流行期间,这一比例可增至20%~70%[2]｡

肺炎支原体没有细胞壁,青霉素类､头孢类等β内酰胺酶类抗生素对其无效,大环内酯类药物是治疗支原体肺炎的首选药物,包括阿奇霉素､克拉霉素､红霉素､罗红霉素和乙酰吉他霉素等,其中阿奇霉素最为常用[3]｡由于抗生素的不规范使用,全球范围内肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药率呈上升趋势,我国肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药率已高达90%[4]｡肺炎支原体23SrRNA基因突变被认为是导致其对大环内酯耐药的主要原因,其中A2063G､A2064G､C2617G突变是目前最为关注的重要的突变位点[5]｡本研究建立了针对23SrRNA基因A2063G､A2064G､C2617G的多重荧光PCR检测方法,并用该方法检测了肺炎支原体核酸阳性的临床样本,初步分析了耐药基因突变情况｡

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源肺炎支原体样本由城阳区人民医院检验科保存｡所有阳性样本均通过商品化试剂盒检测为肺炎支原体核酸阳性｡

1.1.2主要试剂鼻咽拭子中核酸提取采用磁珠法,试剂盒购自西安天隆公司;六项呼吸道病原体(甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒/腺病毒/肺炎支原体/鼻病毒)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自湖南圣湘科技有限公司;PremixExTaqTM(ProbeqPCR)试剂盒购自大连宝生物(Takara)公司｡

1.1.3引物设计与合成在NCBI网站获得50条肺炎支原体全基因序列,比对分析23SrRNA基因序列,用primerexpress3.0软件设计23SrRNA基因A2063G､A2064G､C2617G点突变的特异检测引物和探针｡引物和探针由上海生物工程股份有限公司合成｡见表1｡

表1本研究设计的多重荧光PCR的引物和探针

1.1.4阳性质粒构建以肺炎支原体23SrRNA基因参考序列X68422.1中2000~2700位置序列片段为模板,委托上海生物技术公司以质粒pUC57为克隆载体进行基因合成｡最终获得pUC57-23S-A2063G､pUC57-23S-A2064G､pUC57-23S-C2617G､pUC57-23S-variant(同时包含A2063G､A2064G､C2617G)和pUC57-23S-wild作为标准质粒｡

1.2方法

1.2.1荧光PCR检测体系荧光PCR反应体系含2×PremixExTaq(ProbeqPCR)缓冲液10μl,引物终浓度为200nmol/L,探针终浓度为200nmol/L,DNA模板2μl,用无RNA酶水补足至20μl｡反应条件为95℃2min,95℃5s,60℃60s收集荧光信号,共40个循环｡

1.2.2检测体系性能验证特异性验证:检测pUC57-23S-variant和pUC57-23S-wild标准质粒;敏感性验证:检测1×107~1拷贝/μlpUC57-23Svariant标准质粒;重复性验证:检测1×106拷贝/μl和1×104拷贝/μlpUC57-23S-variant标准质粒,重复10次｡

1.2.3临床样本验证用建立的方法检测303份肺炎支原体核酸样本的突变位点,其中10份样本用上游引物5’-GGTCCTAAGGTAGCGAAATT-3’(引物位置1926~1945,X68422.1),下游引物5’-TCGTACTAGAAGCAACACTCTTCAATC-3’(引物位置2640~2666,X68422.1),扩增23SrRNA基因,扩增片段包含3个突变位点｡通过一代测序比较结果的准确性｡

2、结果

2.1引物和探针验证用特异性检测肺炎支原体23SrRNAA2063G(23SrRNA2063-F,23SrRNA2063-R,A2063G-Probe)､A2064G(23SrRNA2064-F,23SrRNA2064-R,A2064G-Probe)和C2617G(23SrRNA2617-F,23SrRNA2617-R,C2617G-Probe)点突变的引物和探针,分别检测pUC57-23S-A2063G､pUC57-23SA2064G､pUC57-23S-C2617G和pUC57-23S-wild质粒｡点突变探针仅检测各自对应的突变位点,对其他突变位点无交叉反应,对未发生突变的位点也无扩增(图1)｡证明设计的3对引物和探针可用于3个突变位点的检测｡

图1本研究设计的3对引物和探针的扩增曲线

2.2多重荧光RT-PCR方法建立经过优化,最终确定3对引物终浓度为200nmol/L,3条探针终浓度200nmol/L的组合,同时检测3个突变位点｡特异性验证表明,多重荧光PCR方法检测pUC57-23Svariant和pUC57-23S-wild标准质粒,仅pUC57-23S-variant有扩增曲线,3个通道均为阳性(结果未显示);敏感性验证表明,检测1×107拷贝/μl~1拷贝/μlpUC57-23S-variant标准质粒,3个点突变检出下限均为1拷贝/μl(图2);重复性验证表明,检测10次1×106拷贝/μl和1×104拷贝/μlpUC57-23S-variant标准质粒,Ct值接近,变异系数均小于2%,重复性好(表2)｡

图2多重实时荧光PCR灵敏度分析

表2多重荧光PCR鉴别3个耐药突变位点的重复性验证

2.3临床样本的检测用多重荧光PCR方法检测肺炎支原体核酸阳性的临床样本,所有样本均存在A2063G位点突变,其中3份样本同时存在A2063G和A2064G位点突变,所有样本均无C2617G位点突变｡见表3｡

表3多重荧光PCR检测肺炎支原体临床样本

将其中10份样本(包括3份同时存在A2063G和A2064G位点突变的样本)扩增23SrRNA后一代测序,结果与多重荧光PCR相同,准确性100%｡

3、讨论

我国学龄期儿童中肺炎支原体感染率占急性细菌性呼吸道感染的59%[4]｡2023年全球出现了肺炎支原体暴发,2023年3月开始,法国､挪威､美国等多个国家监测到肺炎支原体感染病例逐渐上升[5-7],我国2023年冬季也出现了大规模的儿童肺炎支原体暴发,这次暴发可能与P1-1突变谱系菌株(EC1)和P1-2突变谱系(EC2)有关[8]｡

大环内酯类抗生素是治疗支原体肺炎的一线药物,对儿童比较安全｡肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药率在全球范围内差异较大,和欧洲和美国相比,亚洲国家的耐药率较高[9-11],我国成人患者耐药率达60%~70%,儿童患者超过80%[12],严重影响治疗效果｡耐药性的增加主要是因为肺炎支原体基因组发生了相关耐药基因突变,导致与大环内酯类药物结合力下降,其中23SrRNA基因中A2063G､A2064G的突变与高水平大环内酯类药物耐药有关,C2617G突变与低水平大环内酯类药物耐药有关[13]｡

检测肺炎支原体的耐药突变不仅能反映本地区的耐药情况,也可为临床治疗提供依据｡传统的抗生素敏感性试验相对复杂､耗时,目前多采用核酸技术检测变异位点,常用方法包括一代测序[14]､限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析[15]､实时荧光PCR结合熔解曲线分析(high-resolutionmeltanalysis,HRMA)[16],以及环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)和淬灭探针PCR技术[17]｡但这些技术也有不足之处,比如一代测序需要消耗大量人力,RFLP检测慢,HRMA对PCR仪器性能要求高｡本研究建立了三重荧光PCR方法,可同时检测A2063G､A2064G､C2617G的突变,使用普通的荧光PCR仪即可,对设备要求不高,反应时间仅1h,检测敏感性可达1拷贝/μl｡用该方法检测肺炎支原体核酸阳性的咽拭子样本,发现全部发生了A2063G位点突变,其中3份样本存在A2063G､A2064G双位点突变,未检测到C2617G位点突变｡与我国的监测数据一致,目前我国主要耐药突变为A2063G､A2064G突变,尚未监测到C2617G位点突变[18]｡

本研究建立的检测方法对23SrRNA基因突变监测与一代测序结果比较,准确性达到100%,同时具有高敏感和高特异性,是值得推广的监测耐药基因突变的方法｡

参考文献:

[4]史大伟,刘玲,赵萌萌,等.肺炎支原体肺炎患儿支气管肺泡灌洗液中肺炎支原体耐药基因和13种病原检测结果分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):893-896.

基金资助:山东省重点研发计划项目(2021CXGC011306);

文章来源:宋晓锋,张娟,徐翮飞,等.基于多重荧光PCR法检测肺炎支原体耐药位点[J].中国国境卫生检疫杂志,2025,48(02):107-111.DOI:10.16408/j.1004-9770.2025.02.001.