首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学毕业论文 > 中药学毕业论文 > 核桃分心木总皂苷改善大鼠睾丸功能的机制研究

核桃分心木总皂苷改善大鼠睾丸功能的机制研究

2025-04-22 54 上传者：管理员

摘要：目的探讨核桃分心木（DJF）总皂苷对大鼠睾丸功能的改善作用及可能机制。方法将50只SD雄性大鼠随机分为NC组、MG模型组（MG组）、DJF低剂量组（LDJF组）、DJF中剂量组（MDJF组）和DJF高剂量组（HDJF组），每组10只；NC组每日皮下注射生理盐水500 mg/kg，其余各组连续8周每日皮下注射D-半乳糖500 mg/kg以建立亚急性衰老大鼠模型。皮下注射4周时，LDJF组、MDJF组、HDJF组大鼠分别给予100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的DJF总皂苷提取物灌胃，NC组和MG组大鼠分别给予100 mg/kg生理盐水灌胃，共连续28 d。称量各组大鼠体质量，分析各组大鼠睾丸指数及精子参数，并观察大鼠睾丸组织形态学变化；检测各组大鼠血清中睾酮及氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；Western blot检测相关蛋白表达。结果与NC组相比，MG组大鼠睾丸重量、睾丸指数、血清睾酮、SOD水平及精子密度、存活率、活动度下降，MDA水平升高，睾丸组织中Nrf2和HO-1蛋白表达下调，p53和p21蛋白表达则上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。与MG组相比，HDJF组大鼠睾丸重量、睾丸指数、血清睾酮、SOD水平及精子密度、存活率、活动度升高，MDA水平下降，睾丸组织中Nrf2和HO-1蛋白表达上调，p53和p21蛋白表达下调，差异均有统计学意义（P<0.05）;LDJF组、MDJF组上述指标与MG组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与NC组相比，MG组大鼠睾丸组织生精细胞排列紊乱，细胞数量减少，曲细精管管腔内精子数量明显减少；与MG组相比，给予DJF总皂苷干预后，大鼠睾丸组织形态有所改善，精子数量有所增加，以HDJF组大鼠改善最为明显。结论 DJF总皂苷能有效改善大鼠睾丸功能衰退，这可能与激活Nrf2/HO-1通路，增强抗氧化应激水平，抑制衰老相关蛋白表达有关。

关键词：
D-半乳糖
Nrf2/HO-1通路
总皂苷
核桃分心木
睾丸功能
加入收藏

随着衰老､生活压力增加､生活方式的改变等,男性睾丸系统机能会发生老化,进而引起性欲减退､抑郁､暴躁等不良情绪,对其身心健康和生活质量造成严重影响[1]｡目前衰老的机制尚不清楚,但普遍认为氧化应激损伤是男性生殖器官功能衰退的主要机制之一[2]｡核桃分心木(diaphragmajuglandisfructus,DJF)作为一味临床常用的中医良药,具有固精止遗､涩精缩尿､止泻治痢等多种药用功效,其主要活性成分皂苷类化合物同样具有较高的药用价值[3]｡研究表明,DJF总皂苷具有抗氧化作用,能够很好地清除机体产生的羟基自由基[4]｡此外,动物实验证实,DJF总皂苷可抑制D-半乳糖诱导的小鼠衰老[5-7]｡然而DJF总皂苷是否能够缓解衰老相关的生殖功能衰退目前尚不清楚｡核因子E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)/血红素氧化酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)轴是氧化应激中的关键信号通路,Nrf2作为调控抗氧化应激的一种关键转录因子,在诱导机体的抗氧化应答中起着重要调节作用[8-9];HO-1被认为是一种有效的抗氧化剂,Nrf2可以调节HO-1启动子活性,在维持细胞内氧化还原平衡中发挥着重要作用[10]｡Nakamura等[11]的研究显示,敲除Nrf2基因能够加速衰老模型鼠的精子生成障碍｡基于既往研究报道结果,本研究通过D-半乳糖皮下注射构建雄性衰老大鼠模型,拟探讨DJF总皂苷对衰老大鼠睾丸功能衰退的影响,以及潜在的分子作用机制,以期为临床改善男性生殖器官功能衰退提供更多理论基础｡

1、材料与方法

1.1实验动物

50只8周龄SD雄性大鼠[使用许可证号:SYXK(陕)2021-003],体质量为(200±20)g,饲养温度为(25±2)℃,湿度为(55±5)%,每12h明暗交替,自由饮水和饮食,所有大鼠适应性喂养1周｡

1.2实验试剂及仪器

DJF(云南玉溪);D-半乳糖(纯度≥99.0%,上海化学试剂总厂);ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司);BCA蛋白定量试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司];Nrf2､HO-1､p21､p53兔抗大鼠抗体(中杉金桥生物技术有限公司);HRP标记山羊抗兔二抗(美国CellSignalingTechnology公司)｡光学显微镜(日本奥林巴斯公司);低温高速离心机(型号TGL20M,北京白洋离心机有限公司);酶标仪(型号MK-3,美国赛默飞世尔科技有限公司)｡

1.3实验方法

1.3.1DJF总皂苷的提取､纯化取核桃果核内的分心木,经粉碎机粉碎后过80目筛,称取100g,置于圆底烧瓶,按1∶20的比例加入75%乙醇,水浴加热回流提取3次,每次2h,所得提取液混合浓缩至50mL,得到粗提液,然后稀释､过滤后利用D-101大孔吸附树脂进行分离､纯化,干燥后所得粉末即为DJF总皂苷｡

1.3.2实验建模将50只SD雄性大鼠适应性喂养1周后,随机分为NC组､MG模型组(MG组)､DJF低剂量组(LDJF组)､DJF中剂量组(MDJF组)和DJF高剂量组(HDJF组),每组10只｡NC组每日皮下注射生理盐水500mg/kg,其余各组连续8周每日皮下注射D-半乳糖500mg/kg以建立亚急性衰老大鼠模型｡皮下注射4周时,LDJF组､MDJF组､HDJF组大鼠分别给予100mg/kg､200mg/kg､400mg/kg的DJF总皂苷提取物灌胃,NC组和MG组大鼠分别给予100mg/kg生理盐水灌胃,共连续28d｡

1.3.3标本采集实验结束,称量各组大鼠体质量,抽取静脉全血约5mL,12000r/min离心20min,取上清,-20℃保存备用｡麻醉并处死所有大鼠,迅速切开阴囊取出睾丸称其湿重,计算睾丸指数(睾丸湿重/体质量);然后取大鼠左侧睾丸进行HE染色病理观察,取右侧睾丸用于Westernblot实验;取附睾尾及输精管分析精子参数｡根据大鼠一般状态､睾丸指数､睾酮水平､睾丸组织形态､精子数量及存活率等评估亚急性衰老大鼠建模情况｡

1.3.4血清中睾酮､超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测取上述离心后的血清样品,根据ELISA试剂盒步骤检测各组大鼠血清中睾酮及氧化因子SOD､MDA水平｡

1.3.5HE染色观察睾丸组织形态学变化取大鼠新鲜睾丸组织制成石蜡组织标本,5µm厚度连续切片,放入烘烤机60℃烘干30min;将切片置入玻片架,依次置入二甲苯中脱蜡2次,每次5min,梯度乙醇脱水5min,加入苏木精溶液染色5min,去除多余染液,加入盐酸乙醇分化30s使组织返蓝,伊红染液染色2min,终止染色,梯度乙醇脱水､二甲苯透明,用中性树胶封片,镜下观察｡

1.3.6精子参数检测取大鼠附睾尾用眼科剪剪碎,并用细针扎破输精管,置于提前预热至37℃的PBS液中,水浴10min,使精子充分溢出,取10µL液体滴于载玻片,自然晾干,4%多聚甲醇固定,显微镜下观察精子活力及密度,2%伊红溶液染色2h后镜检计算精子存活率｡

1.3.7Westernblot检测睾丸组织衰老相关蛋白表达取大鼠睾丸组织加入蛋白裂解液,提取组织总蛋白并检测其浓度,取20µg蛋白进行凝胶电泳,分离蛋白,转至PVDF膜上,封闭1h后分别加入Nrf2､HO-1､p21､p53蛋白一抗(1∶1000)孵育过夜,次日加入相应二抗,室温孵育2h,缓冲液洗涤3次,暗室曝光､显影,用ImageJ软件分析灰度值｡

1.4统计学分析

采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差(xˉ±s)表示,多组间比较采用one-wayANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验;以P0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1亚急性衰老大鼠模型的构建

与NC组相比,其余各组大鼠在注射D-半乳糖后状态逐渐变差,表现为毛发发黄､褪毛,皮肤干燥､松弛,活动量减少,精神状态不佳｡注射D-半乳糖8周后,无大鼠死亡,待各组大鼠完成体质量称量及采血留样后处死大鼠,观察到与NC组相比,MG组､LDJF组､MDJF组､HDJF组大鼠睾丸指数及睾酮水平明显降低,睾丸组织形态破坏,精子数量减少､存活率降低,提示皮下注射D-半乳糖成功建立了亚急性衰老大鼠模型｡

2.2各组大鼠体质量､睾丸重量､睾丸指数比较

实验结束后称量所有大鼠,各组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05);与NC组相比,MG组大鼠的睾丸重量及睾丸指数明显下降,差异有统计学意义(P0.05),LDJF组､MDJF组与MG组上述指标比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1｡

表1各组大鼠体质量､睾丸重量､睾丸指数比较

2.3各组大鼠血清中睾酮､SOD及MDA水平比较

ELISA检测显示,与NC组比较,MG组大鼠血清中睾酮及SOD水平下降,MDA水平升高,差异均有统计学意义(P0.05),见表2｡

表2各组大鼠血清中睾酮､SOD及MDA水平比较

2.4各组大鼠睾丸组织形态学观察

HE染色显示,NC组大鼠睾丸组织结构正常,生精细胞排列整齐,曲细精管中含有大量精子;MG组睾丸组织生精细胞排列紊乱,细胞数量减少,曲细精管管腔内精子数量明显减少;与MG组相比,给予DJF总皂苷干预后,大鼠睾丸组织形态有所改善,精子数量有所增加,以HDJF组大鼠改善最为明显,见图1｡

图1HE染色观察各组大鼠睾丸组织形态变化表3各组大鼠精子参数比较

2.5各组大鼠精子参数比较

检测附睾尾及输精管内精子参数发现,MG组大鼠精子密度､存活率及活动度较NC组下降,差异均有统计学意义(P0.05),见表3｡

2.6各组大鼠睾丸组织衰老相关蛋白表达比较

Westernblot结果显示,与NC组比较,MG组大鼠睾丸组织中Nrf2和HO-1蛋白表达下调,p53和p21蛋白表达则上调,差异均有统计学意义(P0.05);与MG组比较,HDJF组大鼠睾丸组织中Nrf2和HO-1蛋白表达上调,p53和p21蛋白表达则下调,差异均有统计学意义(P0.05),见图2｡

图2各组大鼠睾丸组织衰老相关蛋白表达水平比较

3、讨论

近年来随着生活压力的增大,男性机体衰老过程相对提前,其中生殖器官的衰老及机制研究引起了广泛关注｡在衰老过程中,机体抗氧化能力下降,导致氧自由基增多,随着年龄增长,男性睾丸生殖功能逐渐下降,表现为血清总睾酮及游离睾酮水平下降｡因此,探究衰老对睾丸形态､功能的影响对于延缓男性生殖器官衰老具有重要意义｡D-半乳糖是一种致衰剂,研究证实连续皮下注射大剂量D-半乳糖可获得可靠的衰老模型,已广泛用于衰老机制研究中[12]｡本研究通过构建SD雄性大鼠衰老模型,发现MG组大鼠精子数量减少､存活率降低,睾丸功能下降,睾丸组织形态破坏,提示大鼠衰老模型构建成功｡给予高剂量DJF总皂苷干预后,大鼠睾丸组织形态及功能得到有效改善,提示适量的DJF总皂苷具有延缓大鼠睾丸功能衰退的作用｡

衰老是多种病理､生理及心理过程综合作用,导致机体生理功能退化及丧失的必然过程,目前较为认可的学说是:在衰老过程中多种来源的促氧化剂增加,而抗氧化酶减少,导致机体内氧化还原失衡,造成氧化应激损伤,进而导致细胞衰老[13-14]｡DJF总皂苷提取物具有较强的抗氧化活性,能够清除自由基和超氧离子,提高内源性抗氧化酶活性,增强抗氧化功能[15]｡相关研究也报道,给予DJF醇提物干预能够通过清除自由基,有效改善D-半乳糖诱导的器官衰老和损伤[16]｡Meng等[17]的研究则表明,DJF提取物通过增强细胞活力显著减弱了H2O2在人源正常肝细胞LO2中诱导的氧化损伤,阐明了DJF的潜在生物活性｡而本研究发现,给予高剂量DJF总皂苷干预后,大鼠氧化损伤较MG组显著降低,提示适量的DJF总皂苷干预可降低氧化应激损伤,改善衰老大鼠睾丸功能｡

Nrf2/HO-1信号途径已被证实在抗氧化应激反应中发挥重要作用｡相关研究表明,知母皂苷能够阻断高脂饮食诱导的肥胖大鼠的炎症和血脂异常,改善氧化应激,其原因与Nrf2/HO-1信号通路激活密切相关[18-19]｡太白龙牙总皂苷能提高抗氧化能力,有效改善D-半乳糖诱导的器官损伤,对D-半乳糖诱导的大鼠衰老具有逆转作用,其原因与Nrf2/HO-1通路激活有关[20]｡本研究发现,给予高剂量DJF总皂苷干预后,Nrf2/HO-1通路相关蛋白Nrf2､HO-1表达较MG组显著上调,推断DJF总皂苷可调控Nrf2/HO-1通路活性｡此外,研究证明,p53是细胞衰老的中心介质,而p21是响应p53表达所必需的,激活p53/p21通路能诱导细胞周期阻滞,引发细胞衰老[21]｡Bonda等[22]研究也表明,阻断p53/p21通路明显抑制了细胞衰老过程｡本研究发现,与MG组相比,高剂量DJF总皂苷干预下调了大鼠睾丸组织中p21和p53蛋白表达,说明适量的DJF总皂苷可以抑制衰老蛋白表达,从而延缓D-半乳糖诱导的睾丸组织衰老｡

综上所述,DJF总皂苷可能通过激活Nrf2/HO-1通路,增强抗氧化应激水平,抑制衰老相关蛋白表达,进而缓解大鼠睾丸功能衰退,为下一步DJF的深度开发利用提供了一定的实验依据｡

参考文献:

[1]邓春华,张弛,谢云,等.睾丸衰老的研究现状与展望[J].中华男科学杂志,2020,26(4):291-296.

[4]洪茜茜,叶永丽,张银志,等.核桃分心木化学成分及功能活性研究进展[J].食品研究与开发,2021,42(7):194-202.

[6]周本文,张长城,邓何,等.竹节参总皂苷减轻高脂饮食诱导的小鼠睾丸支持细胞连接功能损伤[J].南方医科大学学报,2023,43(7):1145-1154.

[7]岳博文,倪露,郑莹,等.竹节参总皂苷通过减轻成纤维细胞生长因子21抵抗改善自然衰老大鼠的认知功能障碍[J].中药新药与临床药理,2023,34(5):605-612.

基金资助:陕西省重点研发计划项目(2017NY-195);

文章来源:刘鹏,王震,王英,等.核桃分心木总皂苷改善大鼠睾丸功能的机制研究[J].局解手术学杂志,2025,34(04):284-288.