呼吸道感染是临床一种常见高发疾病，咳嗽是其最常见的症状之一。部分患者咳嗽发作剧烈、频繁，且迁延难愈，甚至发展为慢性咳嗽，给患者带来极大痛苦[1]。目前，西医治疗呼吸道感染引起的咳嗽主要采用镇咳、抗组胺药等对症治疗，存在疗效欠佳、药物不良反应大及停药后病情反复的情况[2,3]。感咳方为成都中医药大学临床经验方，有充分的临床应用基础，处方由广藿香、川射干、蝉蜕、五味子等中药组成，具有清热解表、止咳平喘的功效，可有效改善呼吸道感染患者的咳嗽症状。本研究通过分析鉴定感咳方入血成分，并进行网络药理学分析及动物实验验证，探讨感咳方治疗呼吸道感染咳嗽的作用机制，以期为其制剂开发及临床应用提供科学依据。

一、材料与方法

1 材料

动物 雄性SD大鼠，体质量(200±20)g,购自成都达硕实验动物有限公司。动物许可证号：SYXK(川)2022-255。本实验经成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准(伦理批号：2023DL-001)。

药品与试剂 广藿香，批号：2110008,产地：广东，蝉蜕，批号：D2110046,产地：四川，川射干，批号：2109090,产地：四川，地龙，批号：2112036,产地：广西，佩兰，批号：2112025,产地：江苏，五味子，批号：2110089,产地：辽宁，玄参，批号：2111040,产地：湖北，以上药材饮片均购自四川新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学附属医院主管药师袁强华鉴定为正品。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司生产；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)抗体，武汉三鹰生物技术有限公司生产；磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)抗体，成都正能生物技术有限责任公司生产。

仪器Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪，美国沃特世科技有限公司产品；Triple TOF® 4600高分辨质谱，美国AB SCIEX公司产品；CX31光学显微镜，日本Olympus公司产品；JY300LIE电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；DNM9602G酶标仪，北京普朗新技术有限公司产品；Chemiscope 6100显影仪，上海勤翔科学仪器有限公司产品。

2 实验方法

2.1 测定方法

血清样品的采集与处理 大鼠适应性喂养1周，实验前禁食12 h,自由饮水。按照37.26 g·kg-1(生药/体质量)给予感咳方灌胃药液，每日1次，连续3 d。给药前采集空白血样，末次给药0.5、1.0、2.0 h后眼眶取血，分离血清，并将不同时间点采集的含药血清混合。精密吸取空白血清和含药血清，加入3倍量质谱甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀，离心15 min,取上清液，浓缩干燥，置于-20℃保存。分析前残渣加80%甲醇复溶，涡旋混匀，离心取上清液过0.22μm的微孔滤膜后，供超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry, UPLC-Q-TOF/MS)分析。

色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18(2.1 mm×100.0 mm, 1.8μm);流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);流速：0.3 min·mL-1;柱温：30℃;检测波长：190～400 nm;进样量：5μL。梯度洗脱程序：0～3.0 min, 5%A;3.0～7.0 min, 5%→15%A;7.0～15.0 min, 15%→25%A;15.0～20.0 min, 25%→50%A;20.0～25.0 min, 50%→80%A;25.0～27.0 min, 80%→95%A;27.0～27.1 min, 95%→5%A;27.1～30.0 min, 5%A。

质谱条件 用电喷雾离子源，正、负离子模式采集。正、负离子源电压分别为5 000和-4 500 V;电喷雾离子源温度：500℃;雾化气压力：344.74 kPa;加热气压力：344.74 kPa;帘气压力：241.32 kPa。一级质谱扫描范围：m/z 50～1 700,去簇电压：100 V,碰撞电压：10 V;二级质谱扫描范围：m/z为50～1 250,去簇电压：100 V;碰撞电压：±40 eV。

2.2 网络药理学研究

入血成分靶点与疾病靶点的获取 在PubChem数据库下载入血成分SDF结构文件，导入SwissTargetPrediction数据库，筛选Probability≥0.05的靶点，合并去重后，得到感咳方入血成分相关靶点。在GeneCards数据库中，以“cough”“acute cough”进行检索，去除重复项，获得疾病相关靶点。用在线平台EVenn绘制入血成分靶点和疾病靶点的韦恩图。

蛋白质互作(protein - protein interactions, PPI)分析及核心靶点筛选 将交集靶点导入String数据库，设定物种为人、置信度≥0.7,获得蛋白互作网络。将网络文件导入Cytoscape3.9.1软件，运用插件“CytoNCA”以参数介度中心性(betweenness centra-lity, BC)、紧密中心性(closeness centrality, CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、度中心性(degree centrality, DC)、局部平均连通性(local average connectivity, LAC)、网络中心性(network centrality, NC)中位数为标准简化网络，简化网络运用“MCODE”插件基于默认参数设置筛选核心靶点团，选取靶点团中分数排名前3的靶点作为感咳方治疗咳嗽的核心靶点。

基因本体(gene ontology, GO)与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析 将感咳方潜在靶点输入Metascape数据库，选择“H.sapiens”,进行GO富集分析与KEGG信号通路分析(P<0.01),并下载数据文件，通过微生信在线平台对相关数据进行可视化。

2.3 灌胃药品的制备

称取感咳方原处方药材，加除吸水率外的10倍量水浸泡2 h后回流提取，共3次，每次1 h,合并3次滤液，浓缩干燥制为冻干粉。临用前，取冻干粉20 g,用0.9%NaCl稀释，即得质量浓度为0.5 g·mL-1灌胃药液。

2.4 模型建立[4]4]

30只大鼠适应性喂养1周后，随机选取24只置于自制烟熏箱(100 cm×50 cm×50 cm)中，混合锯木30 g、烟草20 g和干辣椒5 g点燃，烟熏30 min,随后冷刺激10 min,以上操作每日上午、下午各1次，持续1周。当造模组大鼠出现咳嗽、气短、消瘦、萎靡、扎堆等症状时，提示急性支气管炎模型造模成功。

2.5 动物分组与给药方法

将造模成功的大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量实验组，每组6只，另取6只正常饲养的健康大鼠为对照组。低、中、高剂量实验组分别灌胃给予1.86、4.66、9.32 g·kg-1(生药/体质量)感咳方溶液，对照组和模型组给予相应体积0.9%NaCl,每日1次，连续给药7 d,第8天处死大鼠取材。

2.6 样本采集

末次给药后第2天，处死大鼠，收集左上肺组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于制作苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)切片。其余肺组织冻存于-80℃冰箱中，用于后续指标分析。

2.7 HE染色法观察大鼠肺病理变化[5]5]

固定后的左上肺组织依次进行脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色，在显微镜下观察各组大鼠肺组织病理变化。

2.8 ELISA法检测大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10含量

取大鼠肺组织适量，用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗，随后加入PBS匀浆，以1.23×104 r·min-1离心10 min,取上清液，根据ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作，检测肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量。

2.9 蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中PI3K和p-Akt蛋白的表达水平[6]

取大鼠肺组织适量，加入RIPA裂解液匀浆，BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，100℃加热6 min。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育30 min, PBS洗膜后，用ECL显影液显色，显影仪观察拍照，并用Image J软件分析灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。实验数据用表示。多组间比较用单因素方差分析(ANOVA),两两比较用最小显著性差异法(LSD);方差不齐时，则用非参数检验进行比较。

二、结 果

1 感咳方入血成分分析

用UPLC-Q-TOF/MS方法，根据MS精确相对分子质量、MS/MS二级裂解规律、天然产物高分辨质谱自建数据库及相关文献，共鉴定出感咳方入血成分26个，主要为木脂素、黄酮、环烯醚萜类化合物。各成分的质谱信息，见表1。

2 网络药理学分析

2.1 入血成分靶点与疾病靶点获取结果

通过SwissTargetPrediction数据库预测，得到384个入血成分靶点。合并从GeneCards数据库得到的“cough”“acute cough”相关性评分≥5的靶点，去除重复值后得到1 261个疾病靶点，与入血成分靶点进行韦恩分析，得到142个交集靶点。

2.2 PPI分析及核心靶点筛选结果

将142个潜在靶点输入String数据库，将获取的PPI网络用Cytoscape软件进行拓扑学分析。初始网络经计算得DC、BC、CC、EC、LAC和NC中位数分别为7.50、52.69、0.40、0.04、3.49和4.52,经筛选得到42个靶点的简化网络，再经MCODE插件分析，获取13个节点，50条边组成的核心靶点团(得分8.33),选取该靶点团中分数排名前3的靶点作为感咳方治疗咳嗽的核心靶点，其中关键靶点为磷脂酰肌醇激酶3-催化亚基α基(phosphoinositide 3 kinasecatalytic subunit-α,PIK3CA)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、酪氨酸蛋白激酶(Janus kinase, JAK)2。

2.3 GO和KEGG富集分析结果

通过Metascape数据库对142个交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO富集分析得到生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)条目数分别为1691、102、159个。其中，BP主要富集于蛋白质磷酸化、细胞运动的正向调节、激酶活性的正调控；CC主要富集于膜筏、膜微区、神经元细胞体；MF主要富集于蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、磷酸酶结合。KEGG分析富集得到180条信号通路，富集程度较高的通路有PI3K-Akt信号通路、晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end product, AGE)-晚期糖基化终末产物受体(receptor of AGE,RAGE)信号通路及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号通路等。

表1感咳方入血成分分析结果

表2 5组大鼠肺组织中白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的比较(pg·

3 大鼠肺组织病理变化

低、中、高剂量实验组分别给予1.86、4.66、9.32 g·kg-1(生药/体质量)感咳方；对照组和模型组均给予等体积0.9%NaCl。

对照组大鼠肺泡上皮细胞及肺间质结构正常，未见炎性细胞浸润；与对照组相比，模型组大鼠肺组织损伤明显，支气管周围有较多炎细胞浸润，肺泡壁出现增厚，肺泡间隔增宽。与模型组相比，低、中、高剂量实验组大鼠肺泡壁增厚、肺泡间隔增宽及炎细胞浸润程度减轻。结果见图1。

4 各组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量的比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较，高剂量实验组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著降低(P<0.01或P<0.05),IL-10含量显著升高(P<0.01);中剂量实验组中IL-6、TNF-α含量均显著降低(均P<0.05),IL-10含量显著升高(P<0.01);低剂量实验组的IL-10含量显著升高(P<0.05),见表2。

5 5组大鼠肺组织中PI3K和p-Akt蛋白表达水平的比较

如图2所示：对照组、模型组和低、中、高剂量实验组的PI3K蛋白相对表达水平分别为0.38±0.05、0.97±0.10、0.80±0.17、0.68±0.15和0.56±0.10,p-Akt蛋白相对表达水平分别为0.34±0.14、0.93±0.05、0.74±0.12、0.63±0.16和0.49±0.14。与对照组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.01);与模型组比较，低、中、高剂量实验组大鼠肺组织中PI3K、p-Akt蛋白表达均显著降低(P<0.01,P<0.05)。

图2大鼠肺组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白的表达情况

三、讨 论

呼吸道感染通常为细菌、病毒侵袭所致，感染后机体的免疫应答会引起气道内显著的炎细胞浸润和杯状细胞增生，释放大量炎症介质和气道黏液，通过化学或机械刺激触发咳嗽诱导受体[7,8]。当患者气道内促炎因子大量积聚，上皮细胞损伤脱落，咳嗽感受器更容易暴露于各种吸入的刺激物，造成持续损伤和气道重塑，甚至发展为慢性咳嗽[1]。在PPI网络中，根据MOCDE分数得到核心靶点PIK3CA、AKT1和JAK2,KEGG富集分析显示这些靶点均为PI3K/AKT通路的信号分子。有研究报道，PI3K/AKT通路在呼吸道疾病中炎性介质的表达、炎性细胞募集、免疫细胞功能和气道重塑等方面发挥着重要作用[9]。PI3K/Akt的异常活化会使下游因子IκB激酶α(IκB kinaseα,IKKα)磷酸化，导致核转录因子-κB与IKKα解离活化，易位进入细胞核，并与核内特定启动子结合而加速促炎因子表达[10];其激活也能刺激Th2细胞分化，促进IL-4、IL-5及TNF-α等炎症因子分泌，促使嗜酸性粒细胞的分化、聚集、激活，诱导气道炎症的发生、发展[9]。既往研究表明，气管内给予PI3K抑制药LY294002可显著降低卵清蛋白诱导的小鼠支气管肺泡灌洗液总细胞计数、嗜酸性粒细胞计数，抑制IL-5、IL-13和C-C基序趋化因子配体11水平升高，减轻肺部炎症、气道黏液生成及气道高反应[11]。这些研究与网络药理学分析结果相呼应，说明PI3K/AKT信号通路是气道炎症信号传导的重要通路，因此选择该通路进行检测。

本动物实验结果发现，感咳方能改善急性支气管炎大鼠肺组织病理变化，降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高抗炎因子IL-10水平。蛋白质印迹结果提示，感咳方可降低大鼠肺组织匀浆中PI3K、p-Akt蛋白表达水平。本研究提示，感咳方对急性支气管炎大鼠肺组织有保护作用，其机制可能与调节炎症因子水平及抑制PI3K、p-Akt蛋白表达相关。

参考文献:

[2]王开金,李娟,邱菊,等.止嗽散联合枸地氯雷他定对VPIC患者BALF细胞学､支气管上皮及炎症因子的影响[J].中国微生态学杂志,2018,30(7):798-801.

[3]项艳,胡珍,孙亮,等.桂枝温肺化痰汤对呼吸道感染后咳嗽及气道炎症和免疫功能的影响[J].中华中医药学刊,2021,39(4):184-187.

[5]韦杏,邹敏,李崇进,等.壮药龙盘止咳方通过调控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路减轻急性支气管炎小鼠肺损伤[J].中国病理生理杂志,2021,37(10):1828-1837.

[9]庞亚蓉,席建宏,王志旺,等.磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路参与哮喘气道炎症反应的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2021,37(14):1897-1901.

[10]胡志平,何绍前,王传明,等.甘草酸抑制PI3K/AKT/NF-κB减轻胶原诱导型类风湿关节炎大鼠炎症反应[J].中国老年学杂志,2020,40(13):2852-2856.

[12]胡志平,何绍前,何绍前,等.甘草酸抑制PI3K/AKT/NF-κB减轻胶原诱导型类风湿关节炎大鼠炎症反应[J].中国老年学杂志,2020,40(13):2852-2856.

基金资助:四川省中医药管理局中医药重大科技基金资助项目(2021XYCZ005);

文章来源:张雪,袁强华,何成诗等.基于UPLC-Q-TOF/MS探讨感咳方药效物质基础及作用机制的研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):413-418.