首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 影像检验论文 > 检验职称论文 > 肾细胞癌患者测定血液循环肿瘤细胞的临床价值研究

肾细胞癌患者测定血液循环肿瘤细胞的临床价值研究

2020-08-29 240 上传者：管理员

摘要：目的:采用α-FR的配体探针PCR定量检测肾细胞癌(RCC)患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs),并阐释该法测定RCC患者外周血CTCs的初步临床意义。方法:体外ACHN掺血回收实验评估α-FR的配体探针PCR技术检测外周血CTCs的有效性。将2017年2月～2019年10月在我院就诊的50例健康对照者、35例肾脏良性病变者及45例初诊RCC患者纳入本临床试验;RCC患者分为术前、术后两组。采集入组者外周静脉血4mL(RCC患者于术前1d、术后7d采血2次),用上述方法定量检测CTCs。结果:ACHN掺血回收实验提示本方法的检测值同掺入已知数量肿瘤细胞具有很高的相关性(r=0.99),RCC术前组外周血CTCs水平显著高于健康对照组和肾脏良性病变组(P<0.01,P<0.01),并且RCC患者CTCs水平同肿瘤的TNM分期、临床分期显著相关(P<0.01),根治性肾切除术和保留肾单位手术对于T1、T2期不伴转移RCC患者术后外周血CTCs水平的影响无差异(P=0.320)。结论:采用α-FR的配体探针PCR能有效检测RCC患者外周血CTCs,本方法定量检测CTCs可弥补肾癌TNM分期的不足,可能在评估RCC患者治疗效果和监测肿瘤进展方面具有一定的价值。

关键词：
TNM分期
α型叶酸受体
循环肿瘤细胞
治疗效果
肾细胞癌
加入收藏

近10年来,肾癌在全球的发病率大约上升了2%～4%,男性发病率稍高于女性[1,2]。超过85%的肾癌都是肾细胞癌(RCC),RCC缺乏特异性的肿瘤标志物用于疾病诊断、疗效评价及进展监测,仍有约1/3患者在初次就诊时即已存在转移灶[3]。Ashworth于1869年在肿瘤患者外周血中发现了类似于原发肿瘤的恶性细胞,这是有关循环肿瘤细胞(CTCs)的首次报道[4],最新研究提示肿瘤细胞弥散进入循环系统并达到远处靶器官为早发事件,并且CTCs被认为是肿瘤形成远处转移灶的必要条件[5]。美国临床肿瘤学会(ASCO)在2007年将CTCs推荐为乳腺癌的一种肿瘤标志物[6],CTCs在其他肿瘤的临床价值使得其有望成为RCC的肿瘤标志物。叶酸受体(FR)是一种通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜表面的糖蛋白,FR主要在肿瘤细胞中高表达,这是由于肿瘤细胞增殖快,表达大量FR以满足DNA合成的需要[7]。α-FR由257个氨基酸组成,分子量38kDa,有文献报道超过90%的非黏液性卵巢癌其α-FR呈高度表达,而RCC中α-FR阳性表达率仅次于卵巢癌[8];正常肾脏中α-FR有限分布于近端小管的顶膜,在正常情况下不能进入血液循环系统;同时血液循环系统中的血细胞几乎不表达α-FR,这使得通过α-FR来检测RCC患者CTCs成为可能[9]。本文采用α-FR的配体探针PCR技术来检测RCC患者外周血CTCs,并初步阐述其检测的临床意义。现报告如下。

1、资料与方法

1.1临床资料

将2017年2月～2019年10月在我院就诊的50例健康对照者(健康对照组)、35例肾脏良性病变者(肾脏良性病变组)及45例初诊RCC患者(RCC组)纳入本临床试验;RCC患者分为术前、术后两组。健康对照组:男27例,女23例;年龄20～68岁,平均(45.80±12.82)岁;全部无恶性肿瘤证据,亦无家族性肿瘤病史。肾脏良性病变组:男24例,女11例;年龄22～72岁,平均(50.74±14.28)岁;包括肾结石13例、肾积水7例、肾囊肿7例、肾错构瘤6例、肾脂肪瘤2例,病变由影像学、细胞学及病理学检查确诊。RCC组:男19例,女26例;年龄29～87岁,平均(55.58±14.16)岁;所有的RCC均经病理学确诊,其中透明细胞癌31例、嫌色细胞癌4例、乳头状癌8例、肾集合管癌2例。参照2010年AJCC肾癌TNM分期标准,T1期21例,T2期14例,T3期8例,T4期2例;M0期41例,M1期4例;stageⅠ21例,stageⅡ13例,stageⅢ5例,stageⅣ6例;19例接受了根治性肾切除术(RN),3例接受了RN联合局部淋巴结清扫和(或)静脉瘤栓取出术,17例接受了保留肾单位手术(NSS),4例接受了冷冻消融或肾动脉栓塞等姑息性治疗,2例放弃治疗自动出院,见表1。合并其他恶性肿瘤者未纳入该组。

1.2检测方法及指标

静脉血标本均通过常规静脉穿刺得到,舍弃最初的2.5mL血液以降低皮肤来源上皮细胞污染的风险,采用6mL的EDTA抗凝管收集外周静脉血4mL。所有血标本采集后立即置于4℃冰箱暂时保存,并于采血后5h内进行外周血CTCs检测。为防止交叉污染,ACHN掺血回收实验与患者血标本CTCs检测场所相互独立。具体步骤如下。

表1RCC组患者临床资料

1.2.1探针的标记与洗脱

将3mL外周血标本加入15mL离心管,加入冰冷的红细胞裂解液使总体积达到15mL,充分混匀。置于4℃冰箱裂解15min后立即600g,4℃离心10min。弃上清后PBS重悬白细胞沉淀,再次离心尽量去除红细胞碎片。加入400μL冰冷的PBS重悬沉淀后转至1.5mLEP管中,每份样品加入100μL标记有抗CD45抗体的磁珠后开始于4℃冰箱中混悬孵育。30min后加入800μL的冰冷PBS终止抗原-抗体反应,充分混匀后将其置于磁场10min,免疫磁珠未标记的肿瘤细胞位于上清中,而结合了免疫磁珠的白细胞则在磁场的作用下与肿瘤细胞分离开来,取上清转入新的离心管中离心收集细胞(4℃,600g,10min)。300μLPBS重悬沉淀后再次用耦联有抗CD45抗体的免疫磁珠50μL去除白细胞,同样条件孵育20min后终止反应,磁场作用10min后取上清离心收集细胞。随后加入100μL活化液用以活化和释放肿瘤细胞表面α-FR,离心弃上清后加入特异性识别α-FR并标记有Taqman探针的小片段单链DNA,室温孵育40min后洗涤缓冲液洗涤3次将未结合的多余探针去除。最后利用120μL洗脱液将特异性结合α-FR的单链DNA片段洗脱,加入24μL反应终止液后最后容积为144μL。

1.2.2荧光定量PCR

结合Taqman探针对洗脱的小片段DNA进行特异性扩增,用以间接定量CTCs。本实验所用的Taqman探针在其5’端标记有荧光报告基团6-carboxy-fluoroscein(FAM),3’端标记有荧光淬灭基团6-carboxy-tetramethyl-rhodamine(TAMRA)。每个反应体系中加入预混试剂12.5μL,洗脱的小片段单链DNA模板2.5μL,引物工作液1μL,最后加ddH2O至25μL,每份样品设3复孔。另外标准品分为6个浓度梯度(1.39×10拷贝数/mL、1.39×102拷贝数/mL、1.39×103拷贝数/mL、1.39×104拷贝数/mL、1.39×105拷贝数/mL、1.39×106拷贝数/mL),设两复孔。利用ABIViia7荧光定量PCR仪对待测样品和标准品进行特异性扩增,反应条件如下:步骤1:95℃2min,40℃30s,60℃1min,8℃5min,95℃1min,1个循环;步骤2:95℃10s,35℃30s,72℃5s,40个循环,并在步骤2中35℃退火时检测荧光信号。荧光定量PCR仪将自动检测荧光报告基团产生的荧光信号,特定软件将该荧光信号(△Rn)与Rox参比荧光进行校正分析和演算,用以定义cyclethreshold(Ct),即荧光信号达到所设定阈值时所经历的循环数。Ct的绝对值取决于加入模板的起始拷贝数,采用GraphpadPrism5软件对标准品起始拷贝数的对数和所测得的Ct值进行最小二乘法回归分析得到标准曲线,每个Ct值与相应的原始拷贝数之间呈函数关系。样品原始拷贝数可通过将荧光定量PCR所测得的Ct值代入标准曲线而得到。每份样品3个复孔原始拷贝数的平均值乘以0.144进而转换成拷贝数/3mL。PCR数据处理和临床患者信息统计工作由不同的人员完成。

1.3统计学方法

采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析,一般线性相关分析将用于肿瘤细胞掺血回收实验中计算各浓度检测值与已知数量掺血肿瘤细胞的相关系数。计量资料若服从正态分布用x¯±s表示,呈偏态分布则用中位数表示。计量资料组间比较采用One-wayANOVA或LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1ACHN掺血回收实验检测值与掺入肿瘤细胞数量的相关性

体外肿瘤细胞掺血回收实验能够从外周血中敏感而有效的捕获不同梯度的肿瘤细胞,富集后采用基于α-FR的配体探针PCR技术能在3mL外周血中检测到5～5×104个ACHN细胞,经直线相关分析提示CTC检测值与掺入肿瘤细胞数目呈正相关,相关系数r=0.99(P<0.01),见图1。

图1基于α-FR的配体探针PCR其CTC值与人工掺入ACHN细胞数目直线相关分析

2.2RCC组与阴性对照组CTCs水平比较

单向方差分析(One-wayANOVA)结果提示健康对照组和肾脏良性病变组分别同RCC组术前CTCs值比较差异有统计学意义(P<0.01);而健康对照组和肾脏良性病变组CTCs值比较差异无统计学意义(P=0.99)。经LSD-t检验,RCC患者术前外周血CTCs水平显著高于术后患者(P<0.001)。见图2。

图2健康对照组、肾脏良性病变组同RCC组(术前、术后)之间CTC值的比较

2.3RCC组CTCs水平与肿瘤分期的关系

45例RCC按照肿瘤TNM分期分为T1+T2期组及T3+T4期组两组,RCC术前组中T3+T4期RCC患者的CTCs检测值也显著高于T1+T2期(P=0.005),见图3;各临床分期进行比较分析发现stageⅣCTCs水平明显高于stageⅠ(P=0.043),其余各分期之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见图4。由于集合管癌和嫌色细胞癌数量少(分别为2例和4例),所以本研究未对各种病理类型的RCC之间的CTCs检测值进行比较分析。

图3健康对照组、肾脏良性病变组同T1+T2期、T3+T4期RCC组之间CTC值的比较

图4RCC组临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间CTC值的比较

2.4手术方式对局限性肾癌手术前后CTCs水平的影响

RCC组共有34例T1、T2期不伴转移的局限性肾癌患者(临床分期为Ⅰ、Ⅱ期),其中行RN17例,NSS16例,1例未手术出院。两组手术前后检测的CTCs差值进行比较,结果显示2种手术方式比较差异无统计学意义(P=0.320)。同时RCC患者CTCs水平同患者年龄(<50岁及≥50岁两组)及性别均无明显相关性(P>0.05)。

3、讨论

RCC发病隐匿且恶性程度高,对放化疗均不敏感,一旦出现远处转移预后很差。目前TNM分期仍是RCC患者唯一确定的预后因素,但许多患者的肿瘤分期相近,但在原发肿瘤根治术后其临床预后却差异很大[3]。已经证实CTCs是乳腺癌、大肠癌和前列腺癌伴转移灶患者的独立预后因素;同时RCC患者外周血cadherin-6具有预后价值,尤其是对于E-cadherin缺乏者[10,11,12,13,14]。我们知道无限增殖是恶性肿瘤的特性,在此基础上协同多种因素促进肿瘤的发生、发展及转移;恶性细胞需要摄取大量的叶酸合成嘌呤、嘧啶来满足快速增殖,因而许多上皮来源的恶性肿瘤其α-FR呈过表达状态[4]。已有文献报道RCC组织标本中α-FR呈高表达状态,而人肾癌细胞株CAKI-1也被证实是α-FR高表达的[8,9,15,16]。基于以上事实,本研究尝试在去除红细胞及白细胞的阴性富集技术基础上,利用特异性结合CTCs表面α-FR的小分子DNA探针,联合TaqMan探针荧光定量PCR技术对RCC患者外周血CTCs进行定量检测。为进一步验证该法的可靠性,体外肾癌肿瘤细胞(ACHN)掺血回收实验经直线相关分析提示CTCs检测值与掺入肿瘤细胞数目具有很高的相关性。本研究结果表明,RCC术前外周血CTCs水平较对照组(健康对照组和肾脏良性病变组)显著升高,即使是肿瘤分期较早的患者;这也从侧面说明了本方法的敏感性。

结果显示RCC患者术前外周血CTCs水平与肿瘤的TNM分期及临床分期相关,TNM分期及临床分期愈晚,其外周血CTCs水平愈高;且术后外周血CTCs水平明显低于术前,类似的结果也出现在乳腺癌、膀胱癌CTCs检测中[17,18,19]。出现上述结果的原因可能与肿瘤逐步增大,继而合并缺血、坏死从而利于CTCs入血相关,已有文献报道平均每天每克肿瘤组织释放大约1×106肿瘤细胞进入血液循环[7]。而Bluemke等[20]的研究发现外周血CTCs水平与肿瘤分期、大小无关,并且对手术前后患者外周血CTCs进行比较发现,术后患者CTCs检测的阳性率高于术前(45%vs.37%)。出现这种相互矛盾的结论可能是由于RCC中角质蛋白经常缺乏表达[21],若利用角质蛋白8和角质蛋白18进行检测可能会低估外周血CTCs水平,造成CTCs水平在各个肿瘤分期之间无差异。原发肿瘤切除后机体的瘤负荷显著减低,尽管手术有可能促进肿瘤细胞入血,但CTCs的平均半衰期短[22],机体的免疫系统可将绝大部分入血的肿瘤细胞当作“异己”成分得以清除。所以本研究得出术后7d其外周血CTCs水平显著低于术前的结论并不意外。

据报道超过50%的RCC患者外周血中可发现血浆微卫星病灶,这反映出肾癌血行转移机制。传统理论认为术中对肿瘤组织的操作愈多肿瘤细胞入血的风险愈大。相比于RN,NSS其手术创面血管暴露较多,对肿瘤挤压等操作更多,按照上述理论NSS更容易引起肿瘤细胞入血。但本研究显示对于局限性RCC,不管两组肿瘤的位置和大小,两组间经比较分析认为2种术式(RN/NSS)对肿瘤细胞入血的影响无显著差异。首先,本研究于术后第7天对RCC术后患者检测外周血CTCs水平,因为CTCs半衰期较短,可能无法反映术后外周血CTCs的真实水平;其次,所有的RN或NSS并非同一术者完成,手术熟练程度及技巧对术后CTCs检测结果亦有影响。局限性RCC患者无论选择RN还是NSS,其术后外周血CTCs水平同对照组无显著差异,说明术后形成CTCs的“源头”得以有效截断,同时既往术后随访研究发现NSS的治愈率较高也从侧面说明2种术式对T1期RCC患者临床预后并无差异[23]。有学者报道外周血cadherin-6定量检测有利于预测RCC复发和远处转移[14],一项研究应用磁性细胞分选和免疫细胞化学技术检测了154例RCC患者CTCs,结果发现CTCs与淋巴结同步转移相关,是显著且独立的预后因子[24]。我们也对3例局部进展性肾癌患者进行了短期的随访,并进行CTCs监测。数据显示有1例T3N1M0期患者在术后5个月出现CTCs水平升高,此时影像学尚无任何阳性表现,此后2个月该患者发现肿瘤肺转移。这提示该CTCs检测手段有望成为一种监测RCC进展的工具,当然这仍需大规模多中心前瞻性临床研究来验证。

综上所述,虽然本实验方法不能得到单个的CTCs,无法对CTCs的基因型和表观学进行深入研究。但是采用α-FR的配体探针PCR能有效检测到RCC患者外周血CTCs,也许可作为一种评估RCC患者治疗效果和监测肿瘤进展的潜在工具,为临床医生提供一定的参考价值。当然这尚待开展进一步深入的临床研究。

张磊,周朝阳,谭振琨,苏继峰,胡鹏,李文泽.肾细胞癌患者血液循环肿瘤细胞测定及临床意义[J].临床泌尿外科杂志,2020,35(09):699-703+708.